Полиморфизам дужине амплифицираних фрагмената

Polimorfizam dužine amplificiranih fragmenata odnosno AFLP (na engleskom Amplified Fragment Length Polymorphism) je jedan od najznačajnijih i najkorišćenijih protokola u velikom broju bioloških disciplina. Ima primenu od molekularne biologije i genetike do mikrobiologije i ekologije. U poslednjoj deceniji dvadesetog veka ima ogroman značaj u sudskoj medicini, jer je jedan od protokola korišćen za genotipizaciju. Sam protokol je prošao kroz veći broj modifikacija i usavršavanja, i danas se za kao zvaničnog kreatora protokola uzima Piter Vos, koji je 1995. objavio rad pod imenom Istraživanje Nukleinskih Kiselina.

AFLP protokol se sastoji od sledećih koraka:

• Dugačak DNK lanac se seče sa restriktivnim enzimima. Enzim je biološki katalizator koji ima veliku ulogu u reakcijama. Restrikcioni enzim se koristi u molekularnoj biologiji kao sekač, koji uvek seče oba lanca DNK molekula. Restrikcioni enzim prepoznaje tačno određenu sekvencu na DNK sastavljenu od tačno određenih nukleotida i na tom mestu seče DNK. Na primer, ako restrikcioni enzim prepoznaje sekvencu 5−'ATTATTA−3', kada ide duž DNK molekula u reakciji, i svaki put kad naiđe na gorenavedenu sekvencu na DNK molekulu, enzim će da preseče lanac na tome delu. Enzimi koji se najčešće koriste su oni koji prepoznaju i seku sekvencu od četiri do šest nukleotida. Tokom reakcije koriste se po dva restrikciona enzima, jedan koji prepoznaje i seče sekvencu od šest nukleotida i drugi od četiri.
• Tako isečeni DNK fragmenti na jednom kraju imaju sekvencu koju prepoznaje šestočlani restrikcioni enzim, dok na drugom kraju fragmenta se nalazi sekvenca koju prepoznaje četvoročlani enzima. Fragmenti se onda putem enzima ligaza, koji ima ulogu lepka, spajaju sa adapterima. Adapter je poznata olikonukleotidna sekvenca koja je tako konstruisana da na jednom kraju ima nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci prepoznavanja jednog od upotrebljenih restrikcionih enzima, a na drugom nukleotidnu sekvencu komplementarnu sekvenci prajmera koji će se upotrebiti u preamplifikaciji. Adapter u ovom slučaju ima dve uloge. Prvo vezivanjem adaptera za kraj fragmenta ukida se mesto koje prepoznaju restrikcioni enzimi, a istovremeno dobija se mesto za koje će se vezati prajmer.
• Preamplifikacija je sledeći korak u kojem se u reakcionu smešu stavljaju prajmeri koji su komplementarni sekvencama adaptera i mesta prepoznavanja restrikcionih enzima, ali uz dodatak jednog nukleotida na 3'kraju. Na taj način se umnožavaju samo fragmenti koji se završavaju komplementom tog nukleotida, čime se 16 puta smanjuje broj fragmenata koji će se analizirati.
• Selektivna amplifikacija je sledeći i poslednji korak u kojem se u reakcionu smešu stavljaju unapred određeni prajmeri sa nama poznatim sekvencama, tj. sekvencom prajmera korišćenih u preamplifikaciji uz dodatak 1-5 proizvoljnih nukleotida dodatih na 3'kraju. Zato se ovaj korak i zove selektivna amplifikacija jer je sekvenca kontrolisana, tj selektivna. A kao krajnji rezultat dobijamo amplifikaciju samo određenih fragmenata (obično od 50-100) iz početne šume fragmenata.

Kada se gorenavedeni hemijski proces završi, dobijemo rastvor koji možemo da analiziramo. Analiza se vrši putem elektroforeze, gde se DNK molekul razdvaja na osnovu veličine fragmenata zahvaljujući električnom polju.

Zahvaljujući ovom protokolu moguće je uočiti jasne razlike od gela do gela nakon elektroforeze, i na ovaj način se vrši genotipizacija, odnosno genetička identifikacija.

Literatura

• Vos P. et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acid Research (1995) 23: 4407-4414 [1]