AFLP

Iz projekta Википедија

Polimorfizam dužine amplificiranih fragmenata odnosno AFLP (na engleskom Amplified Fragment Length Polymorphism) je jedan od najznačajnijih i najkorišćenijih protokola u velikom broju bioloških disciplina. Ima primenu od molekularne biologije i genetike do mikrobiologije i ekologije. U poslednjoj deceniji dvadesetog veka ima ogroman značaj u sudskoj medicini, jer je jedan od protokola korišćen za genotipizaciju. Sam protokol je prošao kroz veći broj modifikacija i usavršvavanja, i danas se za kao zvaničnog kreatora protokola uzima Piter Vos, koji je 1995 objavio rad pod imenom Istraživanje Nukleinskih Kiselina.

AFLP protokol se sastoji od sledećih koraka:

Dugačak DNK lanac se seče sa restriktivnim enzimima. Enzim je biološki katalist koji ima veliku ulogu u reakcijama. Restriktivni enzim se koristi u molekularnoj biologiji kao sekač, koji uvek seče oba lanca DNK molekula. Restriktivni enzimi se sastoje od određenog broja nukleotida, dakle imaju tačno određenu sekvencu. Na primer, ako restriktivni enzim ima sekvencu 5−'ATTATTA−3', kada ide duž DNK molekula u reakciji, svaki put kad naiđe na gore navedenu sekvencu na DNK molekulu, enzim će da preseče lanac na tome delu. Enzimi koji se najčešće koriste su oni koji imaju četiri do šest nukleotida. Tokom reakcije koriste se po dva restriktivna enzima, jedan od šest nukleotida drugi od četiri, koji seku DNK molekul na svakom mestu na kojem identifikuju svoju sekvencu.

Tako isečeni DNK fragmenti na jednom kraju imaju sekvencu šestočlanog restriktivnog enzima dok na drugom kraju fragmenta se nalazi sekvenca četvoročlanog enzima. Fragmenti se onda putem enzima Ligaza, koji ima ulogu lepka, spoje, tako da svaki fragment se spoji sa odgovarajućim fragmentom. Na primer, kraj fragmenta koji sadrži sekvencu četvoročlanog enzima će se spojiti sa drugim fragmentom koji takođe na jednom kraju ima tu istu sekvencu.

Preamplifikacija je sledeći korak u kojem se u reakcionu smešu stavljaju prajmeri koji su komplementarni sečenim sekvencama i na taj način se ceo fragment produžava.

Selektivna amplifikacija je sledeći i poslednji korak u kojem se u reakcionu smešu stavljaju unapred određeni prajmeri sa nama poznatim sekvencama, i zato se ovaj korak i zove selektivna amplifikacija jer je sekvenca kontrolisana, tj selektivna.

Kada se gore navedeni hemijski proces završi, dobijemo rastvor koji možemo da analiziramo. Analiza se vrši putem elektroforeze, gde se DNK molekul razdvaja na osnovu veličine fragmenata zahvaljujući električnom polju.

Zahvaljujući ovom protokolu moguće je uočiti jasne razlike od gela do gela nakon elektroforeze, i na ovaj način se vrši genotipizacija, odnosno genetska identifikacija.