Електронски микроскоп

Узрочник маларије (Пласмодиум) снимљен трансмисионим електронским микроскопом.

Легура алуминијума с 4% бакра, а микроструктура показује таложење бакра (тамни делови) унутар основе алуминијума.

Електронски микроскоп изумљен у Немачкој 1932, а ширу је биолошку примену остварио је током раних педесетих, с радом Ђеорга Палада, Фритиофом Сјестрандом, и Китом Портером, који су били међу његовим првим истакнутим корисницима. Уместо видљиве светлости и оптичких сочива, електронски микроскоп користи зраке електрона, које усмерава фокусирајући електромагнетно поље. Таласна дужина електрона је знатно краћа од таласне дужине фотона видљиве светлости, те је гранична резолуције електронског микроскопа пуно мања од оне светлосног микроскопа: око 0,1 - 0,2 нм за електронски микроскоп у поређењу с око 200 - 350 нм за светлосни микроскоп.^[2] Међутим, за биолошке узорке стварна граница резолуције обично није нижа од 2 нм или је виша, због проблема с припремом препарата и контрастом. Електронски микроскоп има око 100 пута већу моћ разлучивања од светлосног микроскопа. Консеквентно је и искористиво повећање такође веће: до 100.000 пута код електронског микроскопа, у поређењу са 1000 до 1500 пута код светлосног микроскопа. На тај је начин, посматрајући електронским уместо светлосним микроскопом, могуће је запазити много више детаља у грађи ћелије.

Највише су у употреби трансмисијски и скенирајући електронски микроскопи. Примена електронскога микроскопа врло је широка. Познавање структуре чврстих материја, од које зависе њихова својства, може решити многе проблеме хемије, физике, металургије, минералогије, геологије и биологије. Низом електронскомикроскопских снимака могуће је пратити поједине фазе различитих процеса, као на пример процес развијања у фотографији и процес катализе, истраживањем структуре влакана разјашњавају се макроскопска својства ткива, а могућност проматрања света бактерија и вируса, макромолекула, ћелија и многих појединости структуре организма проширује подручје истраживања биологије и медицине.^[3]

Начин рада[уреди | уреди извор]

С оптичким микроскопом који се заснива на обичној светлости не могу се видети предмети чија је дужина мања од таласне дужине употребљене светлости. Моћ увећавања (разлучивост) оптичког микроскопа ограничена је таласном дужином светлости. Моћ увећавања микроскопа је најмањи размак између две честица, од којих објектив микроскопа даје за сваку посебну слику тако да се не сливају заједно. Ова је чињеница дала основу да се катодни зраци, то јест рој електрона који је знатно мање таласен дужине, употреби за изградњу електронског микроскопа. експерименти су наиме показали да се електрони одређене брзине односно енергије понашају као таласи одређене таласне дужине, те да може доћи до интерференције. Такође се показало да се сви електрони који излазе из једне тачке, а пролазе уздуж једне електричне завојнице, опет састају у једној тачки. Та чињенице је омогућила стварање електронске оптике. Електронска оптика састоји се од електронске леће које могу бити магнетске и електростатске. У доњем делу леће силнице се разилазе од осе, па би овде требало да настане дивергенција електронског снопа. Међутим будући да сада електрони имају већу брзину због пређеног електричног напона од 4 000 V, њихово је растурање од осе је мање. Другим речима, настаје конвергенција електронских зрака, па електростатска лећа делује као сабирна лећа.

Према врсти лећа разликују се магнетни и електростатички микроскоп. Код електронског микроскопа с магнетним лећама као извор светлости употребљава се катодна цев, па се електронски сноп концентрише на предмет помоћу прве магнетске леће. Друга магнетска лећа даје увећану слику предмета коју поново повећава трећа магнетска или пројекторска лећа. Притом пут, којим пролазе електрони мора бити вакуум. Притисак у микроскопу износи око 10^-6 бара. Слика предмета се добије на флуоресцентном застору или на фотографској плочи. Снага електронског микроскопа, то јест његова растворна моћ зависи од примењеног електричног напона који обично износи од 20 до 50 kV.

То значи да је заправо повећање електронског микроскопа неограничено. Потребно је само повећати брзину електрона, то јест скратити њихову таласну дужину. То се пак постиже повећањем напона између катоде и аноде у извору електрона. У данашње време се граде електронски микроскопи за повећање и преко 30 000 пута.^[4]

Магнетска лећа[уреди | уреди извор]

Магнетска лећа се састоји од електричне завојнице са фиксним бројем завоја кроз које протиче електрична струја одређене јачине. Од димензија ове завојнице, њеног облика и броја завоја зависи жижна даљина. Кроз завојницу пролази сноп дивергентних зрака из извора А. Електрони ће због деловања магнетског поља на електрични проводник описивати завојиту стазу која ће се савијати све више према оси магнетске леће. Због тога настаје фокусирање, па се у тачки Б добија слика извора А. Одатле следи да и магнетска лећа има својства сабирне леће.

Врсте[уреди | уреди извор]

Постоји више врста електронских микроскопа. Два основна облика су: трансмисиони електронски микроскоп (ТЕМ) и скенирајући електронски микроскоп (СЕМ). Трансмисиони и скенирајући електронски микроскопи су слични по томе што се оба примењују зрак електрона, али за стварање слике користе различите механизме. ТЕМ слику обликује помоћу електрона који се одашиљу кроз препарат. СЕМ скенира површину препарата те слику обликује откривајући електроне који се одбијају од спољње површине препарата. Скенирајућа електронска микроскопија је необична техника због утиска дубине који се стиче посматрањем приказаних биолошких структура.

Због ниске продорне снаге електрона, узорци који се припремају за електронско микроскопирање морају бити изузетно танки. Справа која се користи за ту сврху назива се ултрамикротом. Опремљена је дијамантским ножићем и може резати пресеке дебљине до 20 нм. Постојећи дебљи препарати се такође могу посматрати електронским микроскопом, али је у том случају потребан знатно већи погонски напон како би се довољно повећала продорна снага електрона. Такав високонапонски електронски микроскоп користи погонски напон од неколико хиљада киловолта (kV), што је знатно више у односу на распон од 50 - 100 kV колико је потребно већини конвенционалних инструмената. Пресеци до 1 μm дебљине се могу проучавати искључиво с таквим високонапонским инструментима. Толика дебљина омогућава детаљније истраживање органела и других ћелијских структура.

Трансмисиони електронски микроскоп[уреди | уреди извор]

Трансмисиони електронски микроскоп користи се за посматрање узорака који су за електроне пропусни, па зато дебљина узорака ретко може бити већа од 1 μм. По грађи је сличан оптичком микроскопу, али ради у условима високог вакуума. Као извор електронског снопа служи електронски топ. Њега чини катода, обично волфрамска нит, која загрејавањем емитује електроне (термионска емисија), Вехнелтов цилиндар за фокусирање електронског снопа, те анода с великом разликом потенцијала према катоди. Због те се разлике електрони снажно убрзавају и њихов се сноп првом електронском лећом, која има улогу кондензора, усмерава на узорак (електронска оптика). Проласком кроз узорак електрони се у сусрету с атомима распршују сразмерно дебљини и густини подручја на које наилазе. Преостали, нераспршени електрони чине електронску слику узорка, која се повећава системом електронских лећа (лећа објектива, међулећа, пројекторска лећа). Коначна слика настаје на флуоресцентном заслону, а њезини тамни делови одговарају дебљим и гушћим подручјима узорка. Квалитет слике зависи од врсте контраста, који може бити дифракциони или фазни. При дифракционом контрасту постоје слике светлог и тамног поља, које имају инверзан контраст, а повезане су с дифракционом сликом истог подручја проматраног на микрографији. Из дифракционе се слике препознаје симетрија посматраног узорка, а смерови из дифракционе слике директно се преносе у електронску слику светлог поља, тамног поља или на слику високог разлучења која се темељи на фазном контрасту. На темељу дифракционе слике могуће је одредити кристалну структуру. Међутим, квантитативна информација о микроструктури материјала може се добити детаљном корелацијом дифракционе и електронске слике. Дифракциони контраст одсликава детаље веће од 1,5 нм, а фазни контраст даје разлучивање на нивоу атома. Како електронски сноп путује у вакууму, посебни уређаји омогућују измену узорака без присуства ваздуха.

Трансмисиони електронски микроскоп својим великим корисним повећањем и способношћу разлучивања знатно надмашује могућности оптичког микроскопа, јер је таласна дужина електронског зрачења много мања од таласне дужине светлости. Наиме, максимална разлучивост микроскопа (најмања удаљеност две тачке на којој их је могуће разликовати) ограничена је таласном дужином зрачења које пролази кроз узорак, а одабиром зрачења мањих таласних дужина постиже се боља разлучивост. Данашња се граница разлучивања најснажнијих трансмисионих електронских микроскопа приближава износу од 0,1 nm уз повећање слике од 1,5 милиона пута, а то је довољно за истраживање молекуларне структуре, па и за распознавање атома у кристалима.

Скенирајући електронски микроскоп[уреди | уреди извор]

Скенирајући или растерски електронски микроскоп служи за проучавање рељефа површине узорака, који могу бити и масивни, за електроне непропусни, а њиме се може врло добро осликати тродимензионалност узорка. Системом електронских кондензорских лећа електрони се фокусирају (жариште) у врло узак сноп, који се отклонским електронским лећама усмерава на површину узорка и тако је, тачку по тачку, претражује у облику растера. Деловање снопа на површину узрокује емисију секундарних електрона, које је у емисијском начину рада могуће регистрирати као слику на заслону катодне цеви. С обзиром на начин записивања сигнала који настају интеракцијом електронског снопа и површине разликују се рефлексијски, апсорпцијски, трансмисиони, рендгенски и катодолуминисцентни начин рада.

Специфичне технике у електронској микроскопији[уреди | уреди извор]

У електронској микроскопији је развијено више специфичних техника, од којих је свака тек другачији начин припремања узорка за трансмисијско електронско микроскопирање. Овдје наводимо само неке.

Техником негативног бојења се узорци не режу на ултратанке пререзе већ се уместо тога једноставно одлажу у густу електронску боју, омогућавајући нетакнутом препарату да слику ствара издвајајући се од тамно обојене позадине. Ова је техника очигледно примјењива искључиво на врло мале предмете попут вируса или изолованих органела, али омогућава да се изглед облика и површине проучава на још увијек нетакнутим предметима.

Фрактурирање замрзавањем укључује начелно различите начине припреме узорка. Умјесто резања равномјерних пресјека или проучавања цјеловитог материјала, препарати се подвргавју наглом замрзавању – обично у течном азоту – а онда се ударају оштрим рубом сјечива. Ово узрокује ломљење (фрактуру) препарата по линијама природне слабости, што су у већини случајева празни простори у мембранама. Танки слој метала са згуснутим електронима, попут злата или платине се техником "засјењивања" наноси на површину узорка стварајући копију препарата од злата или платине. Копија се потом проучава ТЕМ-ом. Из разлога што линија лома пролази кроз празне просторе у мембранама гдје год је то могуће, копија настала овим поступком је вјеран приказ унутрашњости мембрана. Проучавање узорака фрактурирања замрзавањем је у великој мјери допринело нашем разумијевању грађе мембрана.

Важност[уреди | уреди извор]

Електронска микроскопија је, остварујући детаљна ултраструктурна истраживања, из темеља променила разумевање грађе ћелија. Неке се органеле (попут језгра или митохондрија) довољно добро виде и коришћењем светлосног микроскопа, али се уз помоћ електронског микроскопа могу вршити много детаљнија истраживања. Поред тога, електронска микроскопија је открила ћелијске структуре које су премалене да би се могле приметити светлосним микроскопом. Оне укључују рибозоме, мембране, микротубуле, и микрофиламенте.

Референце[уреди | уреди извор]

^ Ерни, Ролф; Росселл, MD; Кисиелоwски, C; Дахмен, У (2009). „Атомиц-Ресолутион Имагинг wитх а Суб-50-пм Елецтрон Пробе”. Пхyсицал Ревиеw Леттерс. 102 (9): 096101. Бибцоде:2009ПхРвЛ.102и6101Е. ПМИД 19392535. дои:10.1103/ПхyсРевЛетт.102.096101.
^ „Тхе Сцале оф Тхингс”. Оффице оф Басиц Енергy Сциенцес, У.С. Департмент оф Енергy. 2006-05-26. Архивирано из оригинала 2010-02-01. г. Приступљено 2010-01-31.
^ Електронски микроскоп, [1] "Хрватска енциклопедија", Лексикографски завод Мирослав Крлежа, www.енциклопедија.хр, 2017.
^ Велимир Круз: "Техничка физика за техничке школе", "Школска књига" Загреб, 1969.