Genska terapija

Genska terapija je savremen pristup u lečenju ili prevenciji različitih bolesti zasnovan na uvođenju „divljeg” tipa (eng.wild type) gena (genskog materijala) u ćelije zahvaćene mutacijom. Prema načinu unosa genskog materijala, vektorom ili direktnimnim ubacivanjem ogoljene DNK, razlikujemo somatsku gensku terapiju (jetre, mozga, mišića, kože, bubrega) i germinativnu (kod koje se genski materijal unosi u polne ćelije, s tim što promene uzrokovane manipulacijom na reproduktivnim ćelijama neće biti prenesene sledećim naraštajima). U okviru ovog postupka postoji i terapija in vivo kod koje se genski materijal unosi direktno u bolesnika, zatim in vitro, ex vivo adicija ili zamena gena kod ljudi ili na animalnim modelima Osnovni preduslov za gensku terapiju je ovladavanje metodologijom dobijanja izdvojenog gena, koji će se ubacivati u genom. Sekvencioniranje i kloniranje humanih gena poznato je još od 1980. godine, kada je humani gen za proizvodnju insulina (deficijentan kod šećerne bolesti tip 1) ubačen u genom bakterije, koja je počela da proizvodi humani insulin. Ovako dobijeni insulin i danas se koristi u terapiji šećerne bolesti.

U narednim decenijama očekuje se da će se nakon uspešne izolacije gena u kojima su ispoljeni monogenetski poremećaji genskom terapijaom, i po prvi put dobije lek za genetičke bolesti, ili da se uvođenjem DNK i oligonukleotida u ćelije omogući lečenje nenaslednih bolesti, kao što je npr. karcinom.

Međutim genska terapija je još uvek u početnoj fazi istrživanja i razvoja, i može se smatrati eksperimentalnom metodom, sa velikim brojem kliničkih proba. Uspeh genske terapije na svim poljima bio bi, svakako najveće i najvažnije otkriće 21. veka. Teorijske mogućnosti genske terapije su izvanredne, praktična primena pokazuje rezultate, ali to je svakako nedovoljno da zadovolji brojna velika očekivanja, koja u budućnost moraju biti realizovana, pre svega zbog nas i naših potomaka.

Istorija

Kao datum kada je prvi put počela da se primjenjuje genska terapija uzima se 14. septembar 1990. godine, kada je četvorogodišnja devojčica, rođena sa teškom i kombinovanom imunodeficijencijom (retkim urođenim oboljenjem u kome nedostaje gen za enzim adenozindeaminazu neophodan za normalan imunski odgovor, pa je organizam osetljiv na svaki patogen), dobila gensku terapiju. Kod ove devojčice je genska terapija izvedena tako što su prvo uzeti leukociti iz periferne krvi, zatim su kolonizirani u laboratoriji, pa je u tu kulturu leukocita ubačen gen koji nedostaje. Leukociti su nakon toga vraćeni u krv. Genska terapija je kod ove devojčice poboljšala imuni odgovor, ali nije dovela do konačnog izlečenja, zato što genetski tretirani leukociti žive samo nekoliko meseci, pa to zahteva da se terapija ponavlja.

Opšta razmatranja

Genska terapija obuhvata niz in vivo, ex vivo i in vitro metoda i postupaka za prekomponovanje postojećih i unošenje funkcionalnih kopija gena, koji zamenjuju ili nadopunjuju (ne)aktivnost alelnih varijanti koje su odgovorne za mnoge bolesti.

Istrazivači su do sada, testirali nekoliko pristupa genskoj terapiji, ukljucujući:

• Zamenjivanje mutiranih gena koji uzrokuju bolesti sa njihovim zdravim kopijama.
• Inaktiviranje mutiranih gena koji ne funkcionisu nepravilno.
• Ubacivanje novih gena u organizam u cilju borbe protiv bolesti.

Opštepoznati termini kao što su: genetički inženjering, genska manipulacija, gensko kloniranje, tehnologija rekombinantne DNK, DNK kloniranje, genetička modifikacija, molekulsko kloniranje, pa i „nova genetika”, opisuju istoznačne pojmove u oblasti biotehnologije na bazi genetičkog inženjerstva. Svi se odnose na istovetan proces: svrsishodni transfer ciljanih fragmenata i molekula DNK iz jednog organizma u samoreplicirajuće genetičke strukture drugog, ili transgenozu. Takvi transgeni fragmenti DNK se kasnije mogu, u potrebnoj količini kopija, propagirati u „stranoj ćeliji domaćinu”.

Pored genetskog inženjerstva na molekularnom nivou već su odavno u primeni i manipulacije većim kompleksima genetičkog materijala – hromozomima i kompletnim genomima (označene kao hromozomsko i genomsko inženjerstvo).

Oblici genske terapije

Germinativna genska terapija

Cilj zahvata u polnih ćelijama je korekcija poremećene funkcije određenog gena koja uzrokuje neke teške bolesti. Jedna mogućnost ovog lečenja je unos gena u polne ćelije čime bi se poremećaj koriguje u svim ćelijama potomaka.

Prema tome, jasno je da genska manipulacija polnim ćelijama može imati neizbrisive posledice za razvoj budućeg organizma. Tako se npr. U terapiji zametnim nizom genetičke se promene se vrše u spermi, jajašcima ili ćelijama embrionalnom i prenose na buduće generacije. Ova terapija dovodi do suženja zalihe ljudskih gena na koju računaju buduće generacije.

Ovakav vid terapije je nov i potrebno je ispitati njene posledice pre bilo kakvih pokušaja, pa je zbog toga i zabranjena u većini zemalja. Ipak, 2001. godine naučnici su potvrdili rođenje 30 ,,genetski modifikovanih beba’’, čije su majke bile podvrgnute ovoj proceduri.

Somatska genska terapija

Ova vrsta genetičke terapije koju su 1990. godine prvi put primenili French Anderson i grupa naučnika iz Nacionalnog zavoda za zdravlje. zasniva se na intervenciji koja se vrši samo u somatskim ćelijama (telesnim ćelijama, isključujući polne ćelije) nakon koje genetičke promene ne prelaze na potomstvo.

Somatska terapija može povećati broj preživelih osoba sa defektnim genima u njihovim zametnim nizovima – genima i na taj će se način može se prenositi sve veći broj genetskih problema na sledeće generacije.

Budući da današnji prenatalni genetički testovi mogu otkriti da li je fetus ili embrion zahvaćen nekim poremećajem, roditeljima preostaje odluka o pobačaju oštećenog ploda.

Zabrinjavajuća je metoda ovakvih postupaka, osim otkrivanja nepravilnosti na genu, odabir pola deteta. Postupak se sprovodi posmatranjem amnionske tečnosti, a prvi uspešni slučaj sproveden je 1955. godine. Široka primena ovih postupaka sedamdesetih je godina postala je rutina. Osim odabira pola deteta koji je danas najzastupljeniji u azijskim zemljama, naročito Kini, u kojoj se odabiranju najvećim delom muška deca, ovakve metode mogu popraviti kozmetičke poremećaje u jajašcu, spermi i embrionalnom ćelijama budućeg deteta.

Датотека:Генска терапија.jpeg

Genska terapija in vivo i ex vivo

Датотека:Genska terapija 2.jpeg

Jedan od modela genske terapije ex vivo
a – biopsija stem ćelija
b – aplikacija retrovirusnog vektora za transfer normalnog gena
c – rekombinantna DNK sa transferiranim normalnim genom
d – inkorporiranje genetički transformiranih ćelija
(Prema: Mader, 2000.)

In vivo genska terapija

Kod obe terapije transgen se direktno uvodi u ćelije napadnute zarazom. Na ovaj način moguće je lečiti cističnu fibrozu ili mišićnu ditrofiju. Tako bi DMD bila tretirana uvođenjem distrofin gena u mišićne ćelije, a CF uvođenjem CFTR gena u ćelije vazdušnog protoka. Kod obe bolesti su to ćelije čija poremećena funkcija izaziva glavne efekte koji su opasni po život, međutim nisu jedine.

Bolesnici sa cističnom fibrozom mogu da pate od pankreasnog nedostatka, defekta u vas deferensu, problema jetre, dok bolesnici s mišićnom distrofijom imaju problema sa srcem ili defekte CNS-a.

Kada bi i ovi defekti bili uspešno otklonjeni ne znači da bi bolest u potpunosti bila izlečena .

Ex vivo genska terapija

Vrši se uvođenjem transgena u izolovane ćelije, da bi se njima moglo manipulisati in vitro. Zatim se vrši selekcija onih ćelija koje su primile transgen, pa se ovi ćelijski klonovi ponovo uvode u telo pacijenta.

Ovaj oblik terapije je pogodan za genetičke defekte koji se odnose na krvne ćelije. Korišćen je u lečenju dificijencije adenozin deaminaze (ADA) i to je jedina genska terapija koja je do sada dala rezultate kliničkog poboljšanja.

Adicija ili zamena gena

U ovom tretmanu defektni gen se u potpunosti zamenjuje funkcionalnim transgenom, što bi obezbedilo terapiju za sve tipove mutacija. Zamena bi uključivala homologu rekombinaciju između transgena i hromozomalne kopije, što je moguće, jer se genetičari oslanjaju na ovakvu rekombinaciju.

Zamena gena zahteva procedure u kojima se bira mali broj ćelija kojima je promena potrebna. ,,Germline’’ terapija zahteva precizne zamene gena , jer je to jedini siguran način da se obezbedi kompletno normalna ekspresija gena. Smatra se da je zato ova terapija još uvek nemoguća, što svakako dovodi u pitanje gore navedene podatke o rođenju ,,prvih genetski modifikovanih beba’’. Iz dostupne literaturu može sa saznati da su se uglavnom vodile rasprave o tome da li je to moguće ili ne, ali nema čvrstih dokaza koji bi nas mogli ubedili da je ovaj tip genske terapije uspešano primenjen, iako je sama procedura opisana i teoretski svakako moguća.

Animalni modeli

Kako genske terapije zahtevaju niz eksperimenata , ne mogu se svi izvoditi na ljudima, pa su animalni modeli korisni za demonstraciju principa i razvoja tehnologije. Kako npr. transgeni miševi pate od sličnih simptoma kao i ljudi, oni mogu da budu animalni modeli u cilju razvoja genske terapije.

Rizici genske terapije

Uz sve prednosti genske terapije, postoje i brojni (stvarni ili hipotetski) rizici aplikacije navedenih biotehnologija.

Mnogi eksperti upozoravaju i na mogućnost inkorporiranja ebola ili MSC virusa ("bolesti ludih krava") u ljudski genom i pojave odgovarajućih i drugih pandemija. Istovremeno, u jednoj od prihvatljivijih hipoteza, naučnici vjeruju da je HIV u genom ljudske vrste inkorporiran konzumacijom majmunskog mesa. Argumentacija da je takva opasnost izbjegnuta u slučaju Ishrane svinjskim mesom i njegovim prerađevinama traži se u činjenici da je ono u ljudski jelovnik uključeno još prije 10–12 milenijuma (u bliskoistočnoj i kineskoj regiji domestikacije), a bez registrovanih masovnih i ozbiljnijih infekcija takve prirode.

Problemi u genskoj terapiji

Način prenošenja gena

Način prenošenja gena iako je jedan od problema, on se prevazilazi vektorima i to virusima, a alternativa njima je kompleks DNK sa lipidima i proteinima (inseriranjem 47-og hromozoma — veštačkog ljudskog) u telo. Ovaj vektor bi automatski funkcionisao pored standardnih 46 hromozoma – ne utičući na njihov rad i ne izazivajući mutacije. To bi bio ogroman vektor sposoban da brine o genetičkom kodu i da ga odredi, na osnovu konstrukcije, a imuni sistem ga ne bi napadao stvarajući negativan odgovor na opisane viruse.

Višegenska oboljenja

Većina genetičkih bolesti zahvata više od jednog gena, a na njih utiče i okolina. Proučavanja koja su vršena na identičnim blizancima pokazuju da oni ne boluju od istih bolesti, što govori o uticaju okoline na razvoj individua.

Razumevanje funkcije gena.

Do sada je otkriveno 100.000 gena, ali je funcija najvećeg broja još uvek nepoznata. Pokušavajući gensku terapiju, a ne znajući kako ceo sistem funkcioniše može da se odredi funkcija gena samo za pojedine bolesti (npr srpasta anemija je oboljenje izazvano greškom na genu koji telu govori kako se sintetiše hemoglobin). Greška u genima koja se javlja postoji već hiljadama godina među ljudima. Kada se jednom sekvenca ljudskog genoma kompletira, sledeći korak će biti određivanje funkcije svakog gena ponaosob.

Neke uporedne karakteristike virusnih vektora

Vektor	Veličina transgena	Integracija	Transdukciona efikasnost	Glavne prednosti	Glavni nedostaci
MMLV	<8kB	Da	Visoka	Stabilna transfekcija ćelija u deobi	Inficira samo ćelije koje se brzo dele
Adeno	<7.5kB	Ne	Visoka	Transfecira ćelije u deobi i van nje, tropizam ka respiratornom tkivu	Prolazna ekspresija, izaziva imuni odgovor, uobičajen humani virus
AAV	<4kB	Da (?)	Visoka	Stabilna transfekcija	Mala veličina transgena, integracija slabo razumljiva
HSV	<20kB	Ne	Niska	Velika veličina transgena, neurotropan.	Prolazna ekspresija, moguće generisanje infekcije sa HSV
Vaccinia	<25kB	Ne	Visoka	Efikasna infekcija ćelija	Limitirana primena kod vakcinisanih ili imunokompromitovanih individua

Literatura

• Flint S. J. i sur., Principles of Virology: Molecular biology, pathogenesis, and control, ASM Press, 2000.
• Viral vetors, urednici Angel Cid-Arregui i Alejandro Garcia-Carranca, Eton Publishing/BioTechniques Books, 2000.
• Nonviral vectors for gene therapy, urednici Leaf Huang, Mien-Chie Hung i Ernst Wagner, Academic Press, 1999.
• Vector targeting for therapeutic gene delivery, urednici David T Curiel i Joanne T Douglas, John Willey & Sons, Inc., 2002.
• Donald De Marco – Benjamin Wiker, arhitekti kulture smrti, Verbum, Split, 2007.
• Darko Polšek, Sudbina odabranih, ArTresor naklada, Zagreb, 2004. Zbornik radova Izazovi bioetike, urednik Ante Čović, Pergamena, Zagreb, 2000.

Spoljašnje veze

Molimo Vas, obratite pažnju na važno upozorenje u vezi sa temama iz oblasti medicine (zdravlja).