Електрофореза

Гел електрофореза

Електрофореза је метод који се између осталог користи у молекуларној биологији како би се раздвојили фрагменти ДНК молекула и утврдили њихове величине према величинама фрагмената које су унапред познате.

Увод

Електрофореза, како само име наговештава, ради на принципу електричног поља у којем се ДНК молекул креће кроз смешу, и краћи ДНК фрагменти се крећу много брже од дужих фрагмената, јер је краћим фрагментима лакше да се крећу кроз смешу. Протеини се такође могу раздвојити на овај начин на основу њиховог наелектрисања и величине. Смеше које се користе за прављење могу бити од различитог материјала, али до сада се најбоље показала смеша, тј. гел направљен од агарозе.

Брзина кретања фрагмената кроз гел зависи од више фактора. Концентрација агарозе је један од фактора. Што је концентрација виша, кретање фрагмената, поготово великих фрагмената, је тежа. Сам облик ДНК фрагмената који се креће такође има утицај на брзину. На пример ДНК молекул може бити линеарни, спирално увијен у круг или линеарни са мањим оштећењима. Сваки од ових облика има другачију брзину кретања, спирално увијени је најбржи, док је линеарни најспорији. Присуство етидијум брома (EtBr) може да успори кретање ДНК молекула јер EtBr има ту особину да може да разреши ДНК молекул при самом кретању. Такође и напон (електрочно поље) који се користи има утицај на кретање, на пример најмање могуће поље је око 5-8 V/cm.

Материјал

Материјал потребан за електрофорезу:

• ДНК фрагменти који ће се анализирати
• Супстанца звана ДНК мердевине која се састоји од смеша ДНК фрагмената познатих величина. ДНК фрагменте који нас интересују када се раздвоје можемо да упоредимо са мердевинама, јер знамо већ унапред њихову величину.
• Пуфер који се обично користи је ТБЕ 0,5x, pH 8,0
• Агароза
• Етидијум бромид (5,25 mg/ml у H₂O)
• Маркер који садржи боју, као што је бромофенол плава, која омогућава да пратимо кретање ДНК фрагмената
• Пластична посуда за електрофорезу
• Чешаљ који пре него што се агароза стврдне ставимо у смешу и кад се агароза стврдне, чешаљ извадимо, и остану нам џепови у које стављамо ДНК фрагменте које желимо да анализирамо.

Прављење гела

Стављање ДНК у гел

• Направити 0,8 % смешу од агарозе у 0,5x TBE. Ово се може припремити тако што се измери 24g агарозе и томе се дода 30 ml 0,5x TBE раствора.
• Ову течну смешу грејати у микроталасној пећници док не прокључа и док течност не постане потпуно бистра.
• Кад је течност потпуно бистра оставити да се мало расхлади до 60°C на собној температури. Притом мешати раствор док се хлади.
• Додати 1 ml Етидијум Брома на сваких 10 ml раствора. Етидијум Бромид је мутаген и зато је неопходно ношење нитрилских рукавица.
• Кад је раствор довољно расхлађен, да не буде превише врућ, течност сипати у пластичну посуду за електрофорезу.
• Ставити чешаљ на око 5-10 mm од врха смеше.
• Када се смеша довољно расхлади, отприлике после 30 до 40 минута, агароза се стврдне и смеша постане гел, тј желатинаста смеша, која је довољно флексибилна а и довољно стврднута да се сам гел не распадне. Извадити чешаљ.
• У први џеп, који је направљен захваљујући чешљу се увек ставља ДНК мердевина, а у остале ДНК фрагменти које желимо да анализирамо.

Кретање

Кретање молекула од катоде (-) према аноди (+).

ДНК молекули се крећу у елетричном пољу насталом доводом напона. Како је ДНК молекул, па самим тим и фрагменти, негативно наелектрисан, он се креће од негативно наелектрисане катоде ка позитивно наелектрисаној аноди. И при том кретању се фрагменти према својој величини раздвајају.

Резултат

Као крајњи продукт имамо гел са раздвојеним фрагментима, као што је на слици лево. У првој и последњој колони можемо да видимо мердевине које садрже различите величине и помоћу којих можемо да упоредимо фрагменте у средини. Боја бромофенол плава је успела да се надовеже на ДНК фрагменте и помоћу ово боје је уопште и могуће сада видети фрагменте и колико далеко су се кретали од џепова.

Литература

• Improved electrophoretic DNA sequencing technology, NIH Guide, Том 24, Број 9, март 10, 1995.
• Donald Voet; Judith G. Voet (2005). Biochemistry (3 изд.). Wiley. ISBN 9780471193500. 
• Jahn, G.C.; D.W. Hall; S.G. Zam (1986). „A comparison of the life cycles of two Amblyospora (Microspora: Amblyosporidae) in the mosquitoes Culex salinarius and Culex tarsalis Coquillett”. J. Florida Anti-Mosquito Assoc. 57: 24—27. 
• Khattak, M.N.; R.C. Matthews (1993). „Genetic relatedness of Bordetella species as determined by macrorestriction digests resolved by pulsed-field gel electrophoresis”. Int. J. Syst. Bacteriol. 43 (4): 659—64. 
• Barz, D.P.J.; P. Ehrhard (2005). „Model and verification of electrokinetic flow and transport in a micro-electrophoresis device”. Lab Chip. 5: 949—958. 
• Shim, J.; P. Dutta; C.F. Ivory (2007). „Modeling and simulation of IEF in 2-D microgeometries”. Electrophoresis. 28: 527—586.