Optički mikroskop

Optički binokularni mikroskop

Upotreba	Posmatranje malog uzorka
Srodni delovi	Optički mikroskop

Optički - svetlosni mikroskop je optički instrument koji koristi deo elektromagnetnog spektra - vidljivu svetlost, za povećanje slika malih, golim okom nevidljivih bliskih objekata, kao i za razdvajanje bliskih tačaka na njima. On je prvi pronađeni tip mikroskopa.

Istorijat

Mikroskop iz 1852. godine

Antoni van Levenhuk

I prvi najprostiji mikroskop lupa – tzv. jednostavni mikroskop, kao i optički sistem svih složenijih, tzv. sastavljenih mikroskopa, koji su jedino i zadržali naziv mikroskop, kao osnovnu i najvažniju optičku jedinicu imaju sočiva.

Brusač stakla , Holanđanin Antoni van Levenhuk je bruseći stakla posebnim tehnologijama pravio kvalitetna sočiva . Sistemi njegovih sočiva postavljenih u optičkoj osi bili su u stvari prvi mikroskopi. Gledati ono što se golim okom ni ne naslućuje bio je svojevrsni spektakl. Tim njegovim optičkim seansama često su prisustvovali i članovi kraljevskih porodica. Njegova sočiva uvećavala su do 250 puta. Smatra se prvim istraživačem protozoa, ljudskih spermatozoida, bakterija i crvenih krvnih ćelija (eritrocita). Nakon smrti svetu je ostavio 247 mikroskopa (od kojih se sedam i danas koristi), ali ne i tajnu pravljenja sočiva. Do toga su budući naučnici morali da dođu sami.

Pretpostavlja se da je prvi mikroskop napravio Zaharije Jansen, holandski zabavljač još 1590. godine.

Prvi mikroskopi bili su, svakako optički- svetlosni, tj. oni koji koriste vidljivu svetlost za mikroskopiranje. U tehničkom smislu to je bilo već samo jedno sočivo, odnosno lupa. Pomoću jednog sočiva se uvećavala slika predmeta.

Prost mikroskop, tj. lupa, nije mogao da postigne zadovoljavajuća uvećanja i jasnoću slike, jer zakrivljujući površinu sočiva lupe, u nameri da lupi smanjimo žižnu daljinu i tako povećamo uvećanje, došlo se do granica tehničkih mogućnosti. Lupa s velikim povećanjem morala bi biti vrlo malena, mnogo manja od najmanjeg sočiva mikroskopa, a to već prelazi tehničko-tehnološke mogućnosti njihove izrade.

Kada bi izgradnja ovakvih sočiva i bila moguća, ovako dobijena slika bila bi neupotrebljiva, tamna i nejasna- bez oštrine.

Mogućnosti lupe, optičkog sistema sa jednim sočivom, bile su iscrpljene. Problem većih i kvalitetnijih uvećanja uputio je na sistem sočiva postavljen u jednoj optičkoj osi. Već samo dva odgovarajuća sočiva, istina skromno i primitivno, nagoveštavaju ovaj princip kao rešenje. Nastaje takozvani složeni mikroskop. Mikroskop je konačno uvećao sliku predmeta mnogo više puta nego lupa, znatno ispravio greške sočiva, i mnogo bolje razdvojio bliske tačke na predmetu.

Tako je konačno nastao optički mikroskop u današnjem smislu reči.

Mikroskop je vremenom evoluirao. Potreba za većim i preciznijim uvećanjima, za boljom rezolucijom, tj. moći razdvajanja posmatranih tačaka, kao i potrebe korigovanja raznih devijacija nastalih prolaskom svetlosti kroz sočiva kako bi slika predmeta bila što objektivnija, kao i tehnološki napredak nauke, su usavršavali mikroskop. Objektiv i Okular okular nisu više bila samo dva Sočivo sočiva, već vremenom, čitav niz povezanih i usklađenih, kompatibilnih sistema sočiva.

Sve zahtevnije potrebe tražile su i nova rešenja mikroskopa. Vremenom nastaju i druge vrste mikroskopa. Nastaju mikroskopi sa ultravioletnom svetlošću pa do današnjih rendgenskih, elektronskih, protonskih i drugih.

Sastavni delovi optičkog mikroskopa

Šematski prikaz delova mikroskopa

Mikroskop je građen iz mehaničkog i optičkog dela.

Mehanički delovi mikroskopa

a) Podloga

Podloga je donji dio mikroskopa koji nosi sve ostale delove.

b) Stalak

Stalak se nadovezuje na podlogu i on nosi u gornjem delu tubus sa okularom i objektivom, u srednjem stolić d, a sa donjim delom je vezan za podlogu

c) Tubus

Tubus je metalna cev koji u svom donjem delu nosi objektiv g, a u gornjem okular h. On ima svoju fizičku i optičku dužinu i one se razlikuju. Fizička iznosi oko 160 mm. Optička dužina tubusa je razdaljina između zadnje daljine objektiva i prednje žižne daljine okulara.

d) Stolić

Stolić služi da se na njega postavi objekat-predmet koji se mikroskopira

e) Zavrtnji

Zavrtnjima se reguliše visina tubusa u odnosu na posmatrani predmet. Postoje dva zavrtnja. Veliki makrometarski i mali mikrometarski. Velilkim se grubo postavlja tubus u blizinu samog predmeta, a onda se malim zavrtnjem primiče na potrebnu udaljenost od predmeta. Velika je i višestruka praktična korist od zavrtnja.

Optički delovi mikroskopa

Šematski prikaz objektiva različitih uvećanja

g) Objektiv

Objektiv je omanji cilindrični okvir sa sistemom od jednog ili više sočiva u sebi. Ima navoje i pričvršćuje se zavrtanjem na donji deo tubusa koji je eksponiran objektu - predmetu posmatranja. Stvara realnu, uvećanu i obrnutu sliku predmeta. Postoje i takvi mikroskopi kod kojih tubus ima nastavak koji se zove revolver, a koji na sebi ima već postavljena tri objektiva različite optičke moći. Koji će se od njih upotrebiti zavisi od potrebe mikroskopiranja.

Objektivi su vrlo komplikovane građe a ona zavisi od: 1) veličine povećanja, 2) stepena u kome popravljaju greške sočiva, 3) načina upotrebe i svrhe namene:

 1) Што је веће повећање, објектив је сложеније грађен.
 2) Што је степен у коме поправљају грешке сочива виши, то је и грађа другачија и сложенија. Постоје:

• Ahromatski objektivi- Kod ovih objektiva uklonjena je hromatska aberacija. Sferna aberacije je za jednu boju popravljena kod ahromatskih objektiva.
• fluoritni objektivi – Dobili ime po tome što su njihova sočiva napravljena od fluorita. Prema svojim optičkim kvalitetima ovi objektivi se nalaze na sredini između ahromatskih i apohromatskih objektiva, pa se nazivaju semiapohromatima.
• apohromatski objektivi- Za izgradnju apohromatskih objektiva upotrebljava se veći broj fluoritskih sočiva nego kod običnih fluoritnih objektiva. Kod njih je horomatska aberacija popravljena tako da su sjedinjeni fokusi (žiže) tri različite boje. Time je u celosti uklonjen sekundarni spektar, a preostali tercijerni je tako neznatan da ne utiče na sliku.

3) Građa obzirom na način upotrebe može biti suva i imerizona.

a) Suvi objektivi između frontalne površine sočiva objektiva i predmeta imaju postojeći vazduh. Ovi objektivi su uglavnom oni sa slabijim povećanjem.

b) Imerizoni objektivi su oni objektivi koji između frontalne površine objektiva i predmeta imaju neku imerzionu tečnost. Imerziona tečnost omogućava veći ulazak svetlosti od posmatranog predmeta u objektiv, te samim tim i mogućnost jasnije slike kao i većeg povećanja objektivom. Ovi objektivi se koriste kod većih ukupnih povećanja mikroskopom.

h) Okular

Šematski prikaz okulara različitih uvećanja

Okular je takođe omanji cilindrični okvir, u koga su ugrađena sočiva. Smešten je u gornjem delu tubusa i to do oka posmatrača. Dobijenu sliku objektiva, po principu lupe, ponovo uvećava. Nastala slika je konačna slika dobijena mikroskopom i ona je uvećana, virtuelna, i dalje obrnuta. Postoje okulari za oba oka posmatrača onda se takav mikroskop zove binokularni mikroskop. Postoje i okulari koji imaju dva izlazna okulara za dvojicu posmatrača. Koriste se uglavnom u edukaciji. Okulari su složene lupe. Složenost zavisi od njihovog uvećanja. Okulari su duži kod slabijih uvećanja i obrnuto.

l) Sprava za osvetljavanje Predmeti se osvetljavaju prirodnim svetlom, ili veštačkom rasvetom.

Osvetljavanje predmeta, zavisno od vrste predmeta i potreba posmatranja se vrši:

• odozdo - najčešći vid
• odozgo
• sa strane

Sprava za osvetljavanje postoji kod svih mikroskopa. Čine je, odozdo ka stoliću sa predmetom, ovim redom postavljeni delovi: ogledalo (kombinacija ravnog i konkavnog), nosači za filtere, dijafragma ili iris zastor i kondenzator. Kod mikroskopa sa slabijom optičkom moći čine je kombinacija ravnog i konkavnog ogledala i dijafragma za regulaciju obima svetla kojim se mikroskopira. Zahtevniji mikroskopi, zavisno od potreba i ukupnog uvećanja mikroskopa, mnogo su složenije građeni. Pored obaveznih delova imaju i ležajeve za filtere i kondenzator.

Kondenzor omogućava dovoljno jako i ravnomerno osvetljavanje predmeta. Građen je od sistema sočiva i ima svoju žižnu daljinu. Zavrtnjima se može pomicati vertikalno po optičkoj osi mikroskopa, sa kojom je kompatibilan, čime se vrši njegovo fokusiranje. Za većinu potreba u mikroskopiranju prednju žižu kondenzora treba dovesti u ravan posmatranog preparata.

Iris zastor - dijafragma, svojim promenljivim otvorom propušta odgovarajuću, maksimalnu količinu svetla odbijenog od mikroskopskog ogledala.

r) Predmetno i pokrovno staklo. Na predmetno staklo se postavlja predmet za mikroskopiranje. Predmet je uronjen u kap destilovane vode . Preko njih se postavlja pokrovno stakalce. Predmetno staklo je deblje. Pokrovno staklo je tanje i ima svoj indeks loma. Ono difrakcionom svetlu iz posmatranog predmeta uvećava ugao pod kojim ono izlazi propuštajući ga u objektiv. Ono takođe utiče na ukupno uvećanje mikroskopom.

U kakvom fizičkom odnosu stoje okular i objektiv u tubusu

Iznad predmeta postavljen je objektiv. Predmet je postavljen uz samu ravninu prednje žiže objektiva. Okular je udaljen od objektiva toliko da se slika predmeta, realna, obrnuta i uvećana objektivom, projektuje u prednju žižu okulara. Okular, ovu realnu sliku predmeta, uvećanu objektivom, principom lupe, ponovo uvećava i konačno virtuelno prikazuje.

Princip rada mikroskopa

Uprošćeno : Odbijenu svetlost od posmatranog predmeta (objekta), znači tu minijaturnu sliku predmeta, sočivo objektiva uvećava i razdvaja bliske tačke na njemu. Tako definisanu konačnu sliku predmeta u objektivu, sočivo okulara, još jedanput uvećava. Ovo je osnovni princip i sve ostalo su samo složene varijacije. Vrlo je značajno kod mikroskopa razumeti da nije UVEĆANjE mikroskopa i dovoljno za dobijanje potrebne slike predmeta. Uvećanje je samo potreban ali ne i dovoljan uslov za upotrebljivu sliku nastalu mikroskopom. Mnogo je važnija moć razdvajanja bliskih tačaka posmatranog objekta koju provodi objektiv. Ostvarenje funkcije mikroskopa omogućuje srećna okolnost da se povećavanjem zakrivljenosti optičkog sistema objektiva, odnosno usložavanjem njegovog sistema sočiva, smanjuje žižna daljina mikroskopa, pa tako jednim potezom povećavaju, i uvećanje, i moć razdvajanja objektiva.

Kapacitet mikroskopa

Kapacitet mikroskopa je to veći koliko više zadovoljava najmanje tri kriterijuma.

Uvećanje mikroskopa pokazuje koliko je slika predmeta veća od predmeta koga mikroskopiramo. Na taj način dobijamo veću sliku posmatranog objekta.(G= 250xt/f1xf2: Uvećanje mikroskopa je jednako količniku proizvoda normalne vidne daljine i optičke dužine tubusa i proizvoda žižnih daljina objektiva i okulara)

Numerička apertura - Moć razdvajanja objektiva je njegova sposobnost da daje slike dveju međusobno bliskih tačaka razdvojene. Što je veća apertura dobijamo jasniju i oštriju sliku, t.j. sličniju posmatranom objektu - više detalja.(A= n x sinb; Numerička apertura po Ernstu Abeu je proizvod indeksa loma pokrovnog stakalca i sinusa polovine ugla otvora objektiva).

Greške sočiva (kod optičkih i mikroskopa koji sadrže optičke elemente) su: rasip bele svetlosti ili disperzija, hromatska aberacija, sferna aberacija, zakrivljenost ravnine slike. Otklanjaju se postavljanjem sistema komplementarnih sočiva u objektivu i okularu.

Sve ovo i jesu razlozi zašto je mikroskop vrlo komplikovana sprava kod koga je jedino princip prost, a sve ostalo zahtevno i vrlo visokog logističkog i tehničko-tehnološkog nivoa.

Stvaranje slike u mikroskopu

Posmatrani predmet u mikroskopu može biti izvor svetlosti ili tamni predmet kakvi su najčešće objekti koje mikroskopiramo. Naredna razmatranja se uglavnom odnose na tamne predmete koji nisu izvori svetlosti.

Odgovarajuće slike tačaka predmeta nastaju na onim mjestima, gde bi nastale i po zakonima geometrijske optike, o čemu je već govoreno, ali kako se svaka tačka predmeta koji nije izvor svetla i koji je i sam nevidljiv prostim oku, vidi, to je najveća tajna i zagonetka mikroskopa. Postoji nekoliko teorija o tome. Relevantna je Abeova teorija čija ćemo načela i elementarne principe, pokušati razumeti sledećim razmatranjima.

Prirodna ili veštačka svetlost, iz izvora svetlosti ulazi odozdo i upravno na tamni predmet. Kada bi taj predmet bio potpuno neproziran takvim osvetljenjem videle bi se samo njegove konture. Ali ako je on presečen u tankom sloju kroz njega će svetlost moći da prolazi i on će biti upotrebljiv za mikroskopiranje. Kakav god da je predmet, on je sastavljen od većeg ili manjeg broja tačaka, odnosno delova predmeta. Neke tačke, odnosno delovi, su kompaktniji ili manje kompaktni, pa tako, više, odnosno, manje, propustljivi za svetlost. To znači da postoje određeni razmaci između tačaka, ili pukotine, koje bolje propuštaju svetlost.

Predmet se postavi u ravan prednje žižne daljine optičkog sistema mikroskopa. Po zakonu optike koherentna svetlost koja upravno pada na uske pukotine u predmetu, menja pravac svoga kretanja, odnosno vrši otklon. Taj otklon se zove difrakcija svetlosti. On je presudan za formiranje pojedinosti predmeta u ravnini zadnje žižne daljine objektiva. Po zakonima optike i interferencije svetlosnih talasa, neke od zraka svetlosti se poništavaju, neke uvećavaju. To se dešava po određenim pravilima. Za njihovo razumevanje u mikroskopu se umesto predmeta postavlja optička rešetka- (staklena pločica narezana paralelnim zarezima u jednakim razmacima). Breg između dva zareza je u stvari uska pukotina koja propušta svetlost po zakonima difrakcije. Kako je optička rešetka izuzetno pravilno strukturirana na njoj je lakše razumeti formiranje slike pukotina predmeta u ravni zadnje žižne daljine objektiva.

Kroz svaku pukotinu dolazi do otklona zraka svetlosti pod određenim uglovima tako da one, zavisno od uglova, počinju, jedna za drugom, da zaostaju za pola, celu, za tri polovine, za četiri polovine, odnosno pet polovina talasnih dužina svetlosti. Kada se radi o paranom broju polovina talasne dužine svetlosti u pomaku u fazi talasnog fronta, javljaju se tamne pruge i zovu se minimumi, a kada je broj neparan, onda se javljaju svetle pruge i zovu se maksimumi. Postoje: nulti maksimum, prvi do šestog maksimuma.

Bitno je razumeti da pojedine tačke slike predmeta, bilo optičke mrežice ili nekog drugog posmatranog predmeta, ne nastaju nezavisno jedna od druge po zakonima geometrijske optike, već ih stvaraju koherentne zrake svetlosti, koje prolaze kroz razne tačke optičke rešetke, odnosno predmeta.

Abeova teorija smatra da je slika predmeta u ravni zadnje žižne daljine objektiva u stvari slika izvora svetlosti uobličena strukturom uskih pukotina predmeta, nastala od koherentnih zraka svetlosti svih tačaka predmeta. Znači, dobijena slika nije primarna slika predmeta, već drugostepena. Zato on ovu sliku i naziva sekundarnom slikom.

Praktično mikroskopiranje

Čuvanje mikroskopa

Optički kao i mehanički delovi mikroskopa su podložni stresu, vlazi, prašini i ostalim nečistoćama. Postoje pravila po kojima se mikroskop čuva i prenosi. Kada se ne upotrebljava nalazi se pod zaštitnim staklenim zvonom ili u specijalnoj kutiji. Jedino se sme podizati ako se uhvati za rukohvat predviđen na njegovom stalku. Propisan je i način održavanja čistoće optičkih i drugih delova. Objektiv i okular se ne rastavljaju. Nikada se ni jedan dostupan deo sočiva ne dodiruje rukom, osim kada se čisti, a i tada, samo na zato propisan način.

Priprema za mikroskopiranje

Mikroskopiranje, tj. posmatranje mikroskopom, obuhvata nekoliko neizbežnih radnji. Priprema objekta, odnosno predmeta, odnosno preparata za mikroskopiranje. To je složena radnja i zavisi od vrste preparata i namjere posmatranja. Izuzetno se mora obratiti pažnja na čistoću predmetnog i pokrovnog stakla, jer naročito kod većih povećanja, svaka nečistoća će smetati slici posmatranog predmeta.

Pripremljen preparat između stakala se postavlja na stočić i odozdo osvetljava. Vrši se nameštanje kombinacije ravnog, odnosno konkavnog ogledala tako da ono prirodnu svetlost lomi pod pravim uglom i vertikalno ubacuje u kondenzor, odnosno na predmet. Potom se vrši fokusiranje kondenzora da bi se njegova prednja žižna daljina dovela u ravan posmatranog predmeta i na sami predmet. U mikroskopu se postavlja optička kombinacija okulara i objektiva koji daju najmanje povećanje da bi se u mikroskopu lakše dobila slika predmeta. (da bi se predmet pronašao i video u mikroskopu). Zatim se, ukoliko i ovako nije pronađe, preparat u predmetnim staklima lagano pomera horizontalno po mikroskopskom stočiću sve dok se u oku posmatrača konačno ne vidi obris ili sam predmet. Onda se velikim vijkom tubus diže, odnosno spušta da se slika predmeta jasnije pojavi. Kada se slika predmeta pojavi, onda se malim, mikrometarskim vijkom slika predmeta, konačno izoštrava. Kada je na ovaj način dobijena slika predmeta mikroskopom, onda se mogu, zavisno od potrebe, u tubus postavljati kombinacije za jača uvećanja.

Spoljašnje veze

• Milestones in Light Microscopy
• FAQ on Optical Microscopes