Имунохемијске методе

Имунохемијске методе обухватају низ имунолошких тестова који подразумевају детекцију или одређивање титра антигена или антитела у датом узорку серума. Ове методе имају широку дијагностичку примену у клиничкој пракси.

Принцип

Изузетна специфичност антитела за антигене чини антитела важним реагенсима за детекцију и пречишћавање антигена. Обрнуто, као реагенс за идентификацију и квантификацију специфичних антитела користе се антигени. Развитак технике производње моноклонских антитела условио је могућност добијања антитела за готово сваки тип макромолекула, чиме су технике базиране на реакцији антиген-антитело добиле широку примену у истраживачком раду и клиничким испитивањима.

Детекција антигена или антитела је могућа уколико реакција антиген-антитело може бити визуелизована или измерена. Селекција методе зависи од карактеристика антигена (величина, број и структура антигенских детерминанти), карактеристика одговарајућих антитела (специфичност, авидитет) и концентрације антигена који се одређује. Критични фактор који детерминише да ли ће имунски комплекси бити детектовани у растворној форми или као преципитат, поред концентрације антигена коју треба одредити, је однос концентрација антигена и антитела (сходно Хајделбергу и Кендалу).

Технике које се базирају на реакцији антиген-антитело се могу поделити у две категорије: индиректне и директне. Индиректним методама које омогућавају директну визуелизацију имунопреципитата својствена је релативна неосетљивост јер је неопходно присуство довољно реактаната за формирање видљивих преципитата, односно агрегата имунских комплекса. Директна мерења антиген-антитело комплекса су веома осетљива, јер се користе уређаји који директно мере реакцију и не зависе од формирања видљивог преципитата.

Преципитационе методе

Методе са преципитацијом се изводе се у полутечном медијуму, а антиген-антитело системи су подешени тако да се тест одвија у оквиру зоне еквиваленце.

Радијална имунодифузија

Тест се изводи у гелу од агара у који су инкорпорирана одговарајућа антитела за антиген који треба детерминисати. Узорак се аплицира на рупе у агару. Антиген из узорка дифундује радијално кроз гел, интерагује са антителом и када се достигне зона еквиваленце формира се преципитирајући прстен. Према Манцини-ју дијаметар прстена је пропорционалан логаритму концентрације пошто је количина антитела констатнта. Према Фахеy-у брзина дифузије зависна од концентрације антигена се користи за мерења, чиме се скраћује време реакције у поређењу са Манцини-јем. У оба случаја концентрација антигена се одређује коришћењем калибрационе криве која се конструише коришћењем различитих концентрација стандардног антигена. Уколико се појави више од једног прстена дошло је до више антиген-антитело реакција.

Имуноелектрофореза

Електрофоретска сепарација протеина се заснива на разликама у електричном набоју или молекулским масама различитих протеина. Под дејством једносмерне струје кретаће се према аноди односно катоди зависно од сопственог набоја. Ако се после извесног времена сепарација заустави, и протеини се денатурисањем фиксирају за носач, добиће се позната слика електрофоретске сепапарације. Највећу примену данас има електрофореза у полиакриламиду у присуству СДС-а, док су се електрофореза на папиру, целулоза-ацетату и агарозном гелу задржале у клиничким испитивањима.

Када је циљ да се утврди присуство одређеног протеина, и евентуално одреди његова количина у одређеном узорку, електрофорезе протеина одвијају се у полиакриламидним геловима (PAA), који имају одлике молекулског сита. Коришћењем јаког анјонског детерџента, натријум-додецилсулфата (SDS), обезбеђују се услови под којима долази до дисоцијације протеина у индивидуалне полипептидне подјединице и истовремено се минимизира њихова агрегација. У SDS-PAGE геловима, протеини везују СДС чиме стичу негативно наелектрисање. Количина SDS-а који је везан је готово увек пропорционална молекулској тежини полипептида, а независна од пептидне секвенце, тако да SDS-полипептидни комплекси мигрирају кроз PAA гелове у зависности од величине тј. молекулске тежине. Детекција електрофоретски раздвојених денатурисаних протеина врши се имунолошким реакцијама. Антитела специфична за циљне протеине се додају у прорезе који се праве у гелу. Како антитело дифузује кроз гел у зони еквиваленце се формирају преципитинске линије на месту одигравања реакције антиген-антитело. На основу дебљине преципитинских линија се грубо може одредити и количина протеина у узорку.

Електроимунодифузија

Метод се састоји од једнодимензионалне електрофоретске сепарације протеина у агарозном гелу који садржи антисерум. Циљни протеин у узорку преципитира са одговарајућим антителима у гелу у оквиру зоне еквиваленце у облику ракете (тзв. „ракетна електорфореза“). Дужина ракете је пропорционална концентрацији антигена.

Дводимензионална имуноелектрофореза

Уколико се за сепарацију користе медијуми са континуираним градијентом pH, протеини ће мигрирати до вредности pH која одговара њиховој изоелектричној тачки када губе набој, постају неутрални и престају да се крећу. Овим су обезбеђени услови за поступак изоелектрофокусирања. У дводимензионалној електрофорези се протеини у првој димензији сепаришу изоелектрофокусирањем, а у другој димензији која је управна на правац сепарације у првој димензији, подвргавају се SDS-PAGE-у.

Аглутинација

Када је антиген честица, реакција антигена са антителом се детектује аглутинацијом антигена. Термин аглутинин се користи за описивање антитела која аглутинишу корпускуларне антигене. Када је антиген еритроцит користи се термин хемаглутинација. Аглутинациони тестови могу бити квалитативни, када се користе за испитивање присуства антигена или антитела, и квантитативни када се одређује ниво антитела за одређени антиген.

Детерминација крвних група

Свака индивидуа има аглутинишућа антитела на антигене за крвне групе које не поседују. Ова антитела позната и као комплетна или природна антитела припадају IgM класи. IgM антитела су присутна као пентамери који могу симултано да вежу неколико детерминанти еритроцита у непосредној близини и аглутинишу ове ћелије. Комплетна антитела усмерена против детерминанти крвних група се морају диференцирати од некомплетних, која припадају IgG класи и која су мања од IgM и не могу да успоставе везу између две ћелије. До хемаглутинације не долази уколико се дистанца између еритроцита не смањи до те мере да се може премостити IgG антителима, што се постиже суспендовањем еритроцита у албумину или раствору ниске јонске јачине. Аглутинација еритроцита „огрнутих“ некомплетним антителима је могућа додавањем анти-антитела која се везују за некомплетна антитела на два еритроцита која се налазе у непосредној близини (Кумбсова техника).

Аглутинација бактерија (детекција антитела, Видалова реакција)

Суспензија убијених или инактивираних бактерија се користи као антиген и инкубира са серумом пацијента. Појава аглутинације је индикатор присуства одговарајућег антитела у серуму.

Детекција антигена (Груберова реакција)

За класификацију и одређивање типова бактерија чисте културе се инкубирају са одговарајућим класама и антисерумима специфичних за одређени тип.

Индиректна (пасивна) хемаглутинација

Премда се за тестове аглутинације користе корпускуларни антигени, уколико се за еритроците веже растворни антиген (нпр. вирални антиген, попут полисахарида) ови „огрнути“ еритроцити се могу користити за тест аглутинације на растворне антигене.

Тестови инхибиције аглутинације

Директни тестови се заснивају на томе да извесни вируси продукују аглутинине који доводе до аглутинације еритроцита, и уколико серум садржи антитела на виралне аглутинине аглутинација је инхибирана. У индиректним тестовима се користе стабилизовани еритроцити за које су везани антигени и одговарајућа антитела:

• уколико додати узорак не садржи антиген који одговара антителу долази до аглутинације еритроцита (негативан резултат теста);
• уколико је антиген присутан у узорку он се везује антитела и хемаглутинација је инхибирана (позитиван резултат теста).

Методе са обележивачима

Савремене имунолошке методе за квантификацију концентрације антигена су засноване на поседовању чистог антигена или антитела чија количина се може мерити индикаторским молекулом. Антигени и антитела су обележени флуорофорима (имунофлуоресцентне методе), радиоактивно (радиоимунолошке методе), ензимима (ензимске имунолошке методе) или хемилуминисцентним обележивачима (луминисцентне имунолошке методе).

Обележивачи

Радиоактивни обележивачи

Најчешће се користи изотоп ¹²⁵I са полуживотом од 60 дана.

Ензимски обележивачи

Ензими који се често користе су алкална фосфатаза, пероксидаза рена и глукозо-6-фосфат дехидрогеназа.

Флуоресцентни обележивачи

Флуорофоре су молекули који апсорбују енергију коју ослобађају у виду фотона у току временског периода од 10-8 s. Најчешће се користе флуоресцин и родамин.

Луминисцентни обележивачи

Хемилуминисценција је светлост која се емитује током хемијске реакције. Високо активни су естри акридинијума и изолуминол. Биолуминсценција је светлост која се продукује током ензимске реакције. Емитована светлост се мери детектором.

Обележавање антитела

Директно обележавање антитела постиже се везивањем антитела са обојеним или радиоактивно обележеним молекулом. Визуелизација антиген-антитело комплекса постиже се и индиректно, накнадном инкубацијом са обележеним секундарним антителом (анти-антителом). Секундарна антитела могу бити обележена биотином и накнадно инкубирана са стрептавидином/авидином, који су везани за ензим који може дати колориметријску реакцију у присуству одговарајућег супстрата, а активан је само ако је део комплекса антиген/антитело/секундарно антитело-биотин/ стрептавидин.

Биотин и стрептавидин (или авидин) су молекули који се везују са изузетно високим афинитетом и сваки молекул биотина има 4 места за везивање стрептавидина или авидина. Коришћењем овако обележених секундарних антитела видљивост антиген/антитело комплекса се умножава минимално 4 пута. Мерење обележеног лиганда након везивања антигена за антитело се може вршити у течној фази (хомогене методе) или након сепарације везаног од невезаног обележеног лиганда (хетерогене методе).

Хомогене методе

Нема потребе за сепарацијом везаног и слободног обележеног антигена или антитела јер је активност обележивача, обично ензима, модулисана везивањем антитела. Нпр. узорак који садржи анализирани антиген и обележени антиген се инкубирају и компетитори су за везивна места антитела у раствору. Ензимски обележивач антигена је каталитички активан само ако није везан за антитело. Након додавања супстрата хомогеној смеши конверзија супстрата је директно пропорционална концентрацији анализираног антигена у узорку.

Хетерогене методе

Ове методе захтевају додатни корак ради елиминације невезаног антигена или антитела. Оне могу бити:

• компетитивне (сви реактанти се помешају било симултано било секвенцијално). У симултаној методи необележени анализирани антиген и обележени антиген су компетитори за ограничен број антитела. Како антитело има исти авидитет за обележени и необележени антиген, везивање антитела за обележени антиген је инверзно пропорционално концентрацији необележеног антигена. У случају секвенцијалне методе најпре се антителу додаје необележени антиген из узорка. Када реакција достигне равнотежу додаје се коњуговани антиген. Коњугат ће се везати за антитело свуда где везивно место није окупирано необележеним имуногеном. Што је више имуногена у узорку или стандарду, то ће се мања количина антигена везати. Након сепарације концентрација необеолеженог антигена се одређује на основу обележеног.
• некомпетитивне, тзв. „сендвич“ методе, користе се два различита антитела специфична за различите епитопе антигена чија се концентрација одређује. Фиксирана количина једног антигена се причвршћује за површину микротитарске плоче. Раствор који садржи антиген непознате концентрације или серија раствора са познатим концентрацијама антигена се додају и омогућава се везивање за антитело. Невезани антиген се уклања испирањем и додаје се друго антитело које је обележено ензимом или радиоактивним елементом. Што се више антигена везује то је јачи сигнал. Резултати добијени на основу стандардних раствора се користе за конструкцију криве. Од значаја је да ова два антитела не препознају исте детерминанте што се може постићи моноклонским антителима специфичним за различите епитопе.

Имунофлуоресцентне методе

Када је индикаторски молекул обележен флуоросцентним бојама са различитим таласним дужинама ексцитације и емисије, а детекција се врши ласерским уређајима са могућношћу мерења интензитета флуоросценције, ради се о имунофлуоресцентним методама. Ове методе су комбинација хистолошких и имунолошких техника и користе се за детекцију антигена у ткивима, изолованим ћелијама, микроорганизмима. Могу бити директни, када се за детекцију антигена у ткивима, или везаних за ћелије користе се специфична антитела коњугована са флуоресцентним молекулом и индиректни, када се користе анти-антитела обележена флуоресцентним молекулом.

Радиоимунолошке методе (RIA)

Индикаторски молекул је обележен радиоизотопом. Радиоимунолошке методе су најосетљивије квалитативне и квантитативне технике које су нашле широку примену за мерење присуства и концентрације антигена, присуства, концентрације и афинитета антитела и доказивање имунокомплекса.

Ензимске имунолошке методе (ELISA)

У случају ензимских имунолошких метода индикаторски молекул је ковалентно куплован за ензим, а квантификација се врши спектрофотометром који детектује стопу којом ензим конвертује супстрат у обојени продукт. Постоји неколико варијација ове две методе али је најчешће у употреби некомпетитивна метода. Најчешће се користе ензими који конвертују безбојни супстрат у обојени продукт, на пример п-нитрофенилфосфат се конвертује у жути п-нитрофенол алкалном фосфатазом. Компетитивни ЕЛИСА метод (енгл. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) је опција када пар антитела није доступан за циљни молекул. Користи се пероксидаза рена која може бити куплована или са антигеном или са примарним антителом.

Анализе антигена или антитела у форми солубилних имунских комплекса

У техникама за детерминацију непознате концентрације антигена у раствору, имунонефелометрији и имунотурбиметрији, примењује се умерени вишак антитела. Под таквим условима формирају се имуни комплекси који су и даље растворни 0.5 μm величине што је у корелацији са молекуларном масом од 100 милиона Далтона. Такав комплекс садржи око 100 молекула антигена и 200 антитела.

Имунонефелометрија

Имунонефелометрија је апликација нефелометрије за одређивање концентрације антигена. Нефелометрија је оптичка метода којом се мери интензитет светлости расуте од стране честица суспендованих у флуиду или макромолекула у раствору. Заснива се на својству разблажене суспензије микропартикула да расипа светлост.

Иницијални антиген-антитело комплекси су макромолекули који не расипају светлост. Међутим, ови комплекси имају способност да формирају агрегате. Величина агрегата расте у току неколико минута до неколико сати док њихова способност да расипају светлост не достигне максимум. Уколико се концентрација једног реактанта одржава на константном нивоу, онда ће стопа расипања светлости расти са растућом концентрацијом другог реактанта, до достизања максималне вредности. Расута светлост се сакупља и мери у детектору под одређеним углом (најчешће 13-24^ο). Било пораст степена расипања светлости било максимална вредност се могу калибрисати за различите концентрације реактаната ради добијања калибрационе криве. Непознате концентрације се онда могу одређивати мерењем одговора и упоређивањем са стандардном кривом.

У случају вишка антитела, концентрација солубилних имунских комплекса мерена посредством интензитета расуте светлости је пропорционална концентрацији антигена. У случају вишка антигена величина солубилних имуних комплекса опада са порастом концентрације антигена, а на основу измереног сигнала стиче се погрешна слика о ниској концентрацији антигена. Стога се узорак који садржи циљни антиген разблажује до успостављања концентрације која спада у домен растућег дела Хеиделбрерг-Кендалове криве, док тест реагенс садржи константну количину специфичних антитела.

Формирање имунских комплекса се мери у нефелометру након додавања пуфера, специфичног антисерума и узорка који садржи циљни протеин. Ласерски сноп светлости усмерен кроз кивету бива расут од стране имунских комплекса. Електрични сигнал који се системом сочива усмерава ка фотодетектору је пропорционалан интензитету расуте светлости и конвертује се у концентрацију протеина коришћењем стандардне криве. Зависно од геометријског аранжмана детектора детектује се само део расуте светлости. Таласна дужина светлости и величина партикула детерминишу оптимални угао за мерење.

Светлост расута од стране антиген-антитело комплекса се може мерити:

• по завршетку реакције тзв. методом крајње тачке када се дозвољава реакцији да се одигра током дефинисаног времена нпр. 15-30 минута и мери се максималан одговор;
• континуално током реакције тзв. методом фиксног времена базираној на одређивању разлике између две вредности мерене у различитим временским периодима. Прво мерење се обавља након 7,5 секунди од додавања свих компоненти реакције, а друго мерење након инкубације од нпр. 6 мин, 12 мин тј. у складу са упутствима теста. Предност овог метода се огледа у одузимању сигнала који се јавља и у случају када комплекси антигена и антитела нису формирани.

Даљим додавањем антигена или антитела може се проверити да ли је мерење вршено у растућем делу криве, што је случај када додавање антигена резултује у повећању сигнала или ако додавање антитела не доводи до промена у сигналу.

Имунотурбидиметрија

Имунотурбидиметрија је метода којом се концентрација антигена одређује на основу апсорпције светлости од стране солубилних имуних комплекса. Солубилни имуни комплекси се формирају додавањем узорка антисеруму и пуфера, који садржи акцелератор који омогућава кинетичка мерења у складу са принципом фиксираног времена. Повећање апсорпције на 334 или 340 nm se meri u okviru definisanog intervala vremena.

Dodatna Literatura

1. Abbas, Abul K., Lichtman, Andrew H. (2003). Cellular and Molecular Immunology (5. изд.). USA: Saunders. стр. 43—64. CS1 одржавање: Вишеструка имена: списак аутора (веза)
2. Carl D. Deaton; Kameron W. Maxwell; Richard S. Smith & Robert L. Creveling. (1976). „Use of Laser Nephelometry in the Measurement of Serum Proteins”. Clinical Chemistry. 22 (9): 1465—1471. 
3. Miletić, Vojislav D, Miletić, Ivanka (1997). Imunohemijske metode. Beograd: Društvo medicinskih biohemičara Jugoslavije. CS1 одржавање: Вишеструка имена: списак аутора (веза)
4. Thomas Lothar (1998). Clinical Laboratory Diagnosis, Use and Assessment of Clinical Laboratory Results (1. изд.). Frankfurt/Main, Germany: TH-Books Verlagsgesellschaft mbH. стр. 1427—1441.