Пређи на садржај

Високопропусни скрининг

С Википедије, слободне енциклопедије
Роботи високопропусног скрининга

Високопропусни скрининг (скрининг високог капацитета, енгл. High-throughput screening, ХТС) метод је за научно експериментално мерење, који је широко заступљен у пољу откривања лекова и сродним биолошким и хемијским дисциплинама. Користећи роботику, софтвер за обраду података и контролу, уређаје за руковање флуидима и сензитивне детекторе, високопропустни скренинг омогућава истраживачким лабораторијама да брзо спроведу милионе хемијских, генетичких, или фармаколошких тестова. Помоћу овог процеса могу се брзо идентификовати активна једињења, антитела, или гени који модулирају дати биомолекуларни пут. Резултати тих експеримената пружају почетне тачке за дизајн лекова и за разумевање интеракција или улоге датог биохемијског процеса у биологији.

Припрема тестних плоча

[уреди | уреди извор]
Роботска рука рукује тестном плочом

Кључни ХТС лабораторијски прибор или суд за тестирање је микротитрациона плоча: мали контејнер, обично за једнократну употребу и направљен од пластике, који има мрежу малих отвора (ћелија). Генерално, модерне (цирца 2013) микроплоче за ХТС имају било 384, 1536, или 3456 ћелија. Све оне су умношци од 96, што одражава оригиналну микроплочу са 96 ћелија са размаком између њих од 8 x 12 9 мм. Већина ћелија садржи експериментално корисну материју, у зависности од природе експеримента. То може да буде водени раствор диметил сулфоксида (ДМСО) и неког другог хемијског једињења, које је различито у сваком отвору плоче. Отвори исто тако могу да садрже ћелије или ензиме. (Преостале ћелије су празне или садрже нетретиране узорке, које служе као експерименталне контроле.)

Лабораторије за скрининг типично одржавају колекције сток плоча, чија садржај је пажљиво унесен у каталог, и свака од којих је креирана у датој лабораторији или добијена из комерцијалних извора. Сток плоче се не користе директно у експериментима; уместо тога се креирају засебне тестне плоче по потреби. Тестна плоча је једноставно копија стцк плоче, креирања пипетирањем мале количине течности (обично неколико нанолитара) из ћелија сток плоче до кореспондирајућих ћелија комплетно празне плоче.

Реакциона опсервација

[уреди | уреди извор]

Током припреме за тест у сваку ћелију плоче се стави биолошки ентитет који се изучава, као што су протеини, биолошке ћелије, или животињски ембриони. Након периода инкубације током кога се биолошка материја апсорбује, везује за, или на неки други начин реагује са (или не реагује) једињењима у ћелији, врше се мерења на свим ћелијама плоче, било ручно или машински. Ручна мерења су често неопходна кад се користи микроскопија да се (на пример) траже промене или дефекти у ембрионском развићу узроковане једињенима у ћелији, другим речима кад се траже ефекти које рачунар не може лако да одреди. У супротном, машине за специјализовану аутоматску анализу могу да изврше бројне експерименте на ћелијама (као што је осветљавање поларизованим светлом или мерење рефлективности, што може да буде индикација протеинског везивања). У том случају, машина бележи резултате експеримента у облику матрице вредности, у којој је свака вредност мапирана на појединачну ћелију. Машина високог капацитета може да изврши мерења на десетини плоча у току неколико минута, чиме се веома брзо генеришу хиљаде резултата.

У зависности од резултата тог првог теста, може се извести пратећи тест у оквиру истог експеримента. Тај тест се обично ради само на узорцима који су произвели интересантне резултате на примарном тесту (на "хитовима"). Та једињења се одабирају у нове тестне плоче, и затим се понавља експеримент да би се прикупили додатни подаци на овом суженом сету, чиме се потврђују и рафинирају запажања.

Аутоматизација система

[уреди | уреди извор]
Каруселни систем за складиштење огледних плоча који омогућава висок капацитет за складиштење и висок степен доступности

Аутоматизација је важна компонента користности ХТС приступа. Типично, интегрисани роботски систем који се састоји од једног или више робота транспортује огледне микроплоче од станице до станице за додавање узорка и реагенаса, мешање, инкубацију, и коначно очитавање или детекцију. ХТС систем може обично симултано да припреми, инкубира, и анализира мноштво плоча, што додатно убрзава процес прикупљања података. Постоје ХТС роботи који могу да тестирају и до 100.000 једињења на дан.[1] Аутоматски берач колонија убира хиљаде микробних колонија за генетички скрининг високог капацитета.[2] Термин уХТС или ултра-високопропустни скрининг се односи на скрининг (цирца 2008) чија стопа премашује 100.000 једињења на дан.

Експериментални дезајн и анализа података

[уреди | уреди извор]

Својом способношћу брзог скрининга разноврних једињења (као што су мали молекули или сиРНК) ради идентификације активних једињења, ХТС је задњих година довео до експлозије брзине генерисања података.[3] Консеквентно, један од најфундаменталнијих изазова при извођењу ХТС експеримената је да се извуче биохемијски смисао из гомиле података, што се ослања на развој и адаптацију одговарајућих експерименталних дизајнова и аналитичких метода за контролу квалитета и селекцију хитова.[4] ХТС истраживања су једно од поља која је Џон Блум, начелник за науку предузећа Апплиед Протеомицс, Инц., описао на следећи начин: Дошло је време да ако научник не разуме неке од статистичких или рудиментарних техника за обраду података, он или она се не могу сматрати истинским молекуларним биологом и стога једноставно постају "диносауруси".[5]

Контрола квалитета

[уреди | уреди извор]

ХТС тестови високог квалитета су од кључног значаја за ХТС експерименте. За развој ХТС тестова високог квалитета неопходна је интеграција експерименталног и рачунарског приступа за контролу квалитета (QЦ). Три важне компоненте контроле квалитета су (и) добар дизајн плоче, (ии) селекција ефективних позитивних и негативних хемијских/биолошких контрола, и (иии) развој ефективних QЦ метрика за мерење степена диференцијације, тако да се тестови са инфериорним квалитетом података могу идентификовати.[6] Добар дизајн плоче помаже у идентификацији систематских грешака (посебно оних које су везане за позицију ћелије) и одређује какву нормализацију треба користити за уклањање/редуковање утицаја систематских грешака на QЦ и селекцију хитова.[4]

Ефективни аналитички QЦ методи слиже као средства за развој ХТС тестова одличног квалитета. У типичном ХТС експерименту, јасна дистинкција између позитивне контроле и негативне референце као што је негативна контрола је индекс доброг квалитета. Многе мере за процену квалитета су предложене за мерење степена диференцијације између позитивне цонтроле и негативне референце. Однос сигнала и позадине, однос сигнала и шума, опсег сигнала, однос варијабилности експерименталног теста, и З-фактор се користе за евалуацију квалитета података.[4][7] Строго стандардизована средња разлика (ССМД, енгл. Strictly standardized mean difference) је недавно предложена као критеријум за процену квалитета података у ХТС тестовима.[8][9]

Селекција хитова

[уреди | уреди извор]

Једињење које прозводи жељене ефекте у ХТС тесту се назива хитом. Процес њиховог избора се назива селекцијом хитова. Аналитички методи за селекцију хитова скрининга без понављања (обично у примарном тестирању) се разликују од метода са понављањима (обично у конфирматорном тестирању). На пример, метод з-вредности је подесан за тестирање без понављања, док је т-тест подесан за експерименте са понављањима. Прорачун ССМД вредности за тестове без понављање се исто тако разликује од прорачуна за тестове са понављањима.[4]

За селекцију хитова у примарном скринингу без понављања, лако интерпретабилни критеријуми су: просечни умножак промене, средња разлика, проценат инхибиције, и проценат активности. Међутим, они немају способност ефективног изражавања варијабилности података. Метод з-вредности или ССМД могу да опишу варијабилност података на бази претпоставке да свако једињење има исту варијабилност као и негативна референца теста.[10][11] Међутим, ванграничне вредности (аутлајри)[12] су често присутни у ХТС експериментима, и методи као што је з-вредност су сензитивн на ванграничне вредности и могу да буду проблематични. Консеквентно су предлижени робустни методи, као што су метод з*-вредности, ССМД*, метод Б-вредности, и метод базиран на квантилима. Ови методи се користе за селекцију хитова.[4][13][14]

При тестирању са понављањем се директно процењује варијабилност података за свако једињење; консеквентно се може користити ССМД или т-вредност која се не ослања на претпоставке, као што је то случај са з и з* вредностима. Проблем са употребом т-вредности и асоцираних п-вредности је да на њих утичу величине узорка и учинка.[15] Ови параметри потичу из тестирања без разлика просека, и стога нису дизајнирани за мерење величине учинака једињења. За селекцију хитова, примарни фокус је на величини учинка тестираног једињења. ССМД директно процењује величину учинка.[16] Исто тако је показано да је ССМД бољи од других често коришћених параметара за величину учинка.[17] Популациона вредност ССМД параметра је упоредива са свим експериментима и може се користити исти лимит за вредност ССМД популације за мерење величине учинка једињења.[18]

Види још

[уреди | уреди извор]

Референце

[уреди | уреди извор]
  1. ^ Ханн MM, Опреа ТИ (2004). „Пурсуинг тхе леадликенесс цонцепт ин пхармацеутицал ресеарцх”. Цурр Опин. 8 (3): 255—63. ПМИД 15183323. дои:10.1016/ј.цбпа.2004.04.003. 
  2. ^ Девелопмент оф а сцреенинг платформ фор дирецтед еволутион усинг тхе рееф цорал флуоресцент протеин ЗсГреен ас а солубилитy репортер
  3. ^ Хоwе D, Цостанзо M, Феy П, Гојобори Т, Ханницк L, Хиде W, Хилл ДП, Каниа Р, Сцхаеффер M, Пиерре СС, Тwиггер С, Wхите О, Рхее СY (2008). „Биг дата: Тхе футуре оф биоцуратион”. Натуре. 455 (7209): 47—50. Бибцоде:2008Натур.455...47Х. ПМЦ 2819144 Слободан приступ. ПМИД 18769432. дои:10.1038/455047а. 
  4. ^ а б в г д XХД, Зханг (2011). Оптимал Хигх-Тхроугхпут Сцреенинг: Працтицал Еxпериментал Десигн анд Дата Аналyсис фор Геноме-сцале РНАи Ресеарцх. Цамбридге Университy Пресс. ИСБН 978-0-521-73444-8. 
  5. ^ Еисенстеин M (2006). „Qуалитy цонтрол”. Натуре. 442 (7106): 1067—70. Бибцоде:2006Натур.442.1067Е. ПМИД 16943838. дои:10.1038/4421067а. 
  6. ^ Зханг XХ, Еспесетх АС, Јохнсон ЕН, Цхин Ј, Гатес А, Митнаул Љ, Марине СД, Тиан Ј, Стец ЕМ, Кунапули П, Холдер ДЈ, Хеyсе ЈФ, Струлоциви Б, Феррер M (2008). „Интегратинг еxпериментал анд аналyтиц аппроацхес то импрове дата qуалитy ин геноме-сцале РНАи сцреенс”. Јоурнал оф Биомолецулар Сцреенинг. 13 (5): 378—89. ПМИД 18480473. дои:10.1177/1087057108317145. 
  7. ^ Зханг ЈХ, Цхунг ТД, Олденбург КР (1999). „А симпле статистицал параметер фор усе ин евалуатион анд валидатион оф хигх тхроугхпут сцреенинг ассаyс”. Јоурнал оф Биомолецулар Сцреенинг. 4 (2): 67—73. ПМИД 10838414. дои:10.1177/108705719900400206. 
  8. ^ Зханг, XХД (2007). „А паир оф неw статистицал параметерс фор qуалитy цонтрол ин РНА интерференце хигх-тхроугхпут сцреенинг ассаyс”. Геномицс. 89 (4): 552—61. ПМИД 17276655. дои:10.1016/ј.yгено.2006.12.014. 
  9. ^ XХД, Зханг (2008). „Новел аналyтиц цритериа анд еффецтиве плате десигнс фор qуалитy цонтрол ин геноме-сцале РНАи сцреенс”. Јоурнал оф Биомолецулар Сцреенинг. 13 (5): 363—77. ПМИД 18567841. дои:10.1177/1087057108317062. 
  10. ^ XХД, Зханг (2007). „А неw метход wитх флеxибле анд баланцед цонтрол оф фалсе негативес анд фалсе поситивес фор хит селецтион ин РНА интерференце хигх-тхроугхпут сцреенинг ассаyс”. Јоурнал оф Биомолецулар Сцреенинг. 12 (5): 645—55. ПМИД 17517904. дои:10.1177/1087057107300645. 
  11. ^ Зханг XХ, Феррер M, Еспесетх АС, Марине СД, Стец ЕМ, Црацкоwер МА, Холдер ДЈ, Хеyсе ЈФ, Струловици Б (2007). „Тхе усе оф стрицтлy стандардизед меан дифференце фор хит селецтион ин примарy РНА интерференце хигх-тхроугхпут сцреенинг еxпериментс”. Јоурнал оф Биомолецулар Сцреенинг. 12 (4): 645—55. дои:10.1177/1087057107300646. 
  12. ^ Лазар Тењовић. „Аутлајери – изнимци или ванграничне вредности (енг. оутлиерс)” (ПДФ). [мртва веза]
  13. ^ Зханг XХ, Yанг XC, Цхунг Н, Гатес А, Стец Е, Кунапули П, Холдер ДЈ, Феррер M, Еспесетх АС (2006). „Робуст статистицал метходс фор хит селецтион ин РНА интерференце хигх-тхроугхпут сцреенинг еxпериментс”. Пхармацогеномицс. 7 (3): 299—09. дои:10.2217/14622416.7.3.299. 
  14. ^ Бридеау C, Гунтер Г, Пикоунис Б, Лиаw А (2003). „Импровед статистицал метходс фор хит селецтион ин хигх-тхроугхпут сцреенинг”. Јоурнал оф Биомолецулар Сцреенинг. 8 (6): 634—47. ПМИД 14711389. дои:10.1177/1087057103258285. 
  15. ^ Ј, Цохен (1994). „Тхе Еартх Ис Роунд (П-Лесс-Тхан.05)”. Америцан Псyцхологист. 49 (12): 997—1003. ИССН 0003-066X. дои:10.1037/0003-066X.49.12.997. 
  16. ^ XХД, Зханг (2009). „А метход фор еффецтивелy цомпаринг гене еффецтс ин мултипле цондитионс ин РНАи анд еxпрессион-профилинг ресеарцх”. Пхармацогеномицс. 10 (3): 345—58. ПМИД 20397965. дои:10.2217/14622416.10.3.345. 
  17. ^ XХД, Зханг (2010). „Стрицтлy стандардизед меан дифференце, стандардизед меан дифференце анд цлассицал т-тест фор тхе цомпарисон оф тwо гроупс”. Статистицс ин Биопхармацеутицал Ресеарцх. 2 (2): 292—99. дои:10.1198/сбр.2009.0074. 
  18. ^ XХД, Зханг (2010). „Ассессинг тхе сизе оф гене ор РНАи еффецтс ин мултифацтор хигх-тхроугхпут еxпериментс”. Пхармацогеномицс. 11 (2): 199—213. ПМИД 20136359. дои:10.2217/ПГС.09.136. 

Литература

[уреди | уреди извор]

Спољашње везе

[уреди | уреди извор]
Преузето из „https://sr.wikipedia.org/w/index.php?title=Visokopropusni_skrining&oldid=28455700”