Elektroforeza

Illustracija elektroforeze

Illustracija usporene elektroforeze

Gel elektroforeza

Elektroforeza (od grčkog "Ηλεκτροφόρηση" što znači "nositi elektrone") metod je koji se između ostalog koristi u molekularnoj biologiji kako bi se razdvojili fragmenti DNK molekula i utvrdili njihove veličine prema veličinama fragmenata koje su unapred poznate. Elektroforezom se meri kretanje dispergovanih čestica u odnosu na fluid pod uticajem prostorno uniformnog električnog polja. Elektroforeza pozitivno naelektrisanih čestica (katjona) se ponekad naziva kataforeza, dok se elektroforeza negativno naelektrisanih čestica (anjona) ponekad naziva anaforezom.

Uvod

Elektroforeza, kako samo ime nagoveštava, radi na principu električnog polja u kojem se DNK molekul kreće kroz smešu, i kraći DNK fragmenti se kreću mnogo brže od dužih fragmenata, jer je kraćim fragmentima lakše da se kreću kroz smešu. Proteini se takođe mogu razdvojiti na ovaj način na osnovu njihovog naelektrisanja i veličine. Smeše koje se koriste za pravljenje mogu biti od različitog materijala, ali do sada se najbolje pokazala smeša, tj. gel napravljen od agaroze.

Brzina kretanja fragmenata kroz gel zavisi od više faktora. Koncentracija agaroze je jedan od faktora. Što je koncentracija viša, kretanje fragmenata, pogotovo velikih fragmenata, je teža. Sam oblik DNK fragmenata koji se kreće takođe ima uticaj na brzinu. Na primer DNK molekul može biti linearni, spiralno uvijen u krug ili linearni sa manjim oštećenjima. Svaki od ovih oblika ima drugačiju brzinu kretanja, spiralno uvijeni je najbrži, dok je linearni najsporiji. Prisustvo etidijum bromida (EtBr) može da uspori kretanje DNK molekula jer EtBr ima tu osobinu da može da razreši DNK molekul pri samom kretanju. Takođe i napon (elektročno polje) koji se koristi ima uticaj na kretanje, na primer najmanje moguće polje je oko 5-8 V/cm.

Primena

Smer kretanja čestice zavisi od polarnosti njenog naboja, a brzina kretanja povećava se sa brojem naboja i jačinom električnoga polja, dok opada sa porastom veličine čestice. Elektroforetska analiza bioloških makromolekula, kao što su nukleinske kiseline i belančevine, izvodi se na agaroznim i poliakrilamidnim gelovima različite poroznosti, koja se određuje prema veličini čestica. Nakon bojenja, imunske reakcije ili radioaktivnog obeležavanja, te fotografskog snimanja gela, dobija se slika ili grafički prikaz koji se zove elektroforezogram.

U savremenoj praksi, elektroforeza je rutinski i nezamenljivi metod analize serumskih i tkivnih belančevina, u određivanju čistoće pripreme nukleinskih kiselina i u sekvencizanju nukleotida u nukleinskim kiselinama. Jedna od varijanti elektroforeze je izoelektrično fokusiranje.

Elektroforeza se izvodi u uslovima koji omogućavaju prirodnu konformaciju makromolekula nakon potpune denaturacije. Kombinacijom tih metoda na istom gelu dobija se dvodimenzionalna elektroforeza, koja, samo na jednom elektroforetogramu, može otkriti više hiljada belančevina ili se mogu registrovati one koje nedostaju.

Teoretske osnove

Suspendovane čestice imaju površinski električni naboj, koji je pod snažnim uticajem površine adsorbovane vrste, na koju spoljašnje električno polje usmerava elektrostatične Kulonove sile. Prema teoriji o dvoslojnosti, svi površinski naboji tečnosti su kontrolisani difuznim slojem jona, koji ima isto apsolutno punjenje, ali je suprotnog predznaka u odnosu na površinski naboj. Električno polje takođe ispoljava sile na jone u difuznom sloju, koje imaju suprotni smer od onog na površinski naboj. Ova potonja sila zapravo se ne primenjuje na čestice, nego na jone u difuznom sloju, koji se nalaze na određenoj udaljenosti od površine čestica, a deo se prenosi sve do površine čestica, putem viskoznog stresa. Ovaj deo sile se takođe označava kao snaga elektroforetskog zaostajanja.

Kada se primenjuje električno polje i kada se analiziraju naelektrisane čestice u stabilnom kretanju kroz difuzni sloj, ukupna rezultirajuća sila je nula:

$F_{tot}=0=F_{el}+F_{f}+F_{ret}$

S obzirom na otpor za kretanje čestica zbog viskoznosti disperzanta, u slučaju niskog Rejnoldsovog broja i umerene snage električnog polja E, brzina drifta dispergiranih čestica v je jednostavno proporcionalna primenjenom polju, što elektroforetsku mobilnost μ_e definiše kao:

$\mu _{e}={v \over E}.$

Najpoznatiju i naširoko korištenu teoriju elektroforeze razvio je Smoluhovski, 1903.

$\mu _{e}={\frac {\varepsilon _{r}\varepsilon _{0}\zeta }{\eta }}$,

gde je ε_r = dielektrična konstanta medijuma disperzije, ε₀ = dielektrična konstanta slobodnog prostora, (C² N⁻¹ m⁻²), η = dinamička viskoznost disperzijskog medijuma (Pa s), i ζ = zeta potencijal (odnosno elektrokinetički potencijal klizajuće površine u dvostrukom sloju).

Teorija Smoluhovskog je vrlo moćna, jer važi za dispergovane čestice bilo kojeg oblika, u bilo kojoj koncentraciji. Nažalost, ona ima ograničenja valjanosti, jer, na primer, činjenica je da ne uključuje Debajevu dužinu κ⁻¹. Međutim, Debajeva dužina mora biti važna za elektroforezu, kao što se vidi na priloženoj slici. Povećanje debljine dvostrukog sloja (DL) dovodi do uklanjanja tačke zaostajanja snage dalje od površine čestice. Kada je DL deblji, mora biti manja sila retardacije. Detaljna teorijska analiza pokazala je da je teorija Smoluhovskog važeća samo za dovoljno tanke dvostruke slojeve, kada je radijus čestica a mnogo veći od Debajeve dužine:

$a\kappa \gg 1$.

Ovaj model „tankog dvostrukog sloja” nudi ogromne mogućnosti pojednostavljenja, ne samo za teoriju elektroforeze, već i za mnoge druge elektrokinetičke teorije. Ovaj model je važeći za većinu vodenih sistema, gde je Debajeva dužina obično samo nekoliko nanometara. To ne vredi samo za nanokoloide u rastvoru sa jonskom jačinom blizu vodene.

Teorija Smoluhovskog takođe zanemaruje doprinos površinske provodljivosti. U modernoj teoriji to se ispoljava kao uslov malog Duhinovog broja:

$Du\ll 1$

U nastojanju da se proširi opseg važenja elektroforetske teorije, uzet je u obzir suprotni asimptotski slučaj, kada je Debajeva dužina veća od radijusa čestice:

$a\kappa <\!\,1$.

U ovim okolnostima „debelog dvostrukog sloja”, Hikel predviđa sledeće veze za elektroforetsku mobilnost:

$\mu _{e}={\frac {2\varepsilon _{r}\varepsilon _{0}\zeta }{3\eta }}$.

Ovaj model je upotrebljiv za neke nanočestice i nepolarne tečnosti, gde je Debajeva dužina mnogo veća nego u uobičajenim slučajevima.

Postoji nekoliko analitičkih teorija koje uključuju površinsku provodljivost i eliminišu ograničenja malog Duhinog broja, a pioniri su bili Overbik i But. Moderne, rigorozne teorije vrede za bilo koji zeta potencijal i često bilo koji аκ proizlaze uglavnom iz Duhin-Semenihinove teorije.

U ograničenju tankog dvostrukog sloja, ove teorije potvrđuju numeričko rešenje problema O’Brajena i Vajta.

Materijal

Materijal potreban za elektroforezu:

• DNK fragmenti koji će se analizirati
• Supstanca zvana DNK merdevine koja se sastoji od smeša DNK fragmenata poznatih veličina. DNK fragmente koji nas interesuju kada se razdvoje možemo da uporedimo sa merdevinama, jer znamo već unapred njihovu veličinu.
• Pufer koji se obično koristi je TBE 0,5x, pH 8,0
• Agaroza
• Etidijum bromid (5,25 mg/ml u H₂O)
• Marker koji sadrži boju, kao što je bromofenol plava, koja omogućava da pratimo kretanje DNK fragmenata
• Plastična posuda za elektroforezu
• Češalj koji pre nego što se agaroza stvrdne stavimo u smešu i kad se agaroza stvrdne, češalj izvadimo, i ostanu nam džepovi u koje stavljamo DNK fragmente koje želimo da analiziramo.

Pravljenje gela

Stavljanje DNK u gel

• Napraviti 0,8% smešu od agaroze u 0,5x TBE. Ovo se može pripremiti tako što se izmeri 24g agaroze i tome se doda 30 ml 0,5x TBE rastvora.
• Ovu tečnu smešu grejati u mikrotalasnoj pećnici dok ne proključa i dok tečnost ne postane potpuno bistra.
• Kad je tečnost potpuno bistra ostaviti da se malo rashladi do 60 °C na sobnoj temperaturi. Pritom mešati rastvor dok se hladi.
• Dodati 1 ml Etidijum Broma na svakih 10 ml rastvora. Etidijum Bromid je mutagen i zato je neophodno nošenje nitrilskih rukavica.
• Kad je rastvor dovoljno rashlađen, da ne bude previše vruć, tečnost sipati u plastičnu posudu za elektroforezu.
• Staviti češalj na oko 5-10 mm od vrha smeše.
• Kada se smeša dovoljno rashladi, otprilike posle 30 do 40 minuta, agaroza se stvrdne i smeša postane gel, tj želatinasta smeša, koja je dovoljno fleksibilna a i dovoljno stvrdnuta da se sam gel ne raspadne. Izvaditi češalj.
• U prvi džep, koji je napravljen zahvaljujući češlju se uvek stavlja DNK merdevina, a u ostale DNK fragmenti koje želimo da analiziramo.

Kretanje

Kretanje molekula od katode (-) prema anodi (+).

DNK molekuli se kreću u eletričnom polju nastalom dovodom napona. Kako je DNK molekul, pa samim tim i fragmenti, negativno naelektrisan, on se kreće od negativno naelektrisane katode ka pozitivno naelektrisanoj anodi. I pri tom kretanju se fragmenti prema svojoj veličini razdvajaju.

Rezultat

Kao krajnji produkt imamo gel sa razdvojenim fragmentima, kao što je na slici levo. U prvoj i poslednjoj koloni možemo da vidimo merdevine koje sadrže različite veličine i pomoću kojih možemo da uporedimo fragmente u sredini. Boja bromofenol plava je uspela da se nadoveže na DNK fragmente i pomoću ovo boje je uopšte i moguće sada videti fragmente i koliko daleko su se kretali od džepova.

Vidi još

• Afinitetna elektroforeza
• Kapilarna elektroforeza
• Dielektroforeza
• Gel-elektroforeza
• Imunoelektroforeza
• Izoelektrično fokusiranje
• Izotahoforeza
• Elektroforeza pulsirajućeg polja

Literatura

• Dukhin, S.S.; B.V. Derjaguin (1974). Electrokinetic Phenomena. J. Willey and Sons. 
• Hunter, R.J. (1989). Foundations of Colloid Science. Oxford University Press. 
• Lyklema, J. (1995). Fundamentals of Interface and Colloid Science. vol. 2. str. 3.208. 
• Improved electrophoretic DNA sequencing technology, NIH Guide, Том 24, Број 9, март 10, 1995.
• Donald Voet; Judith G. Voet (2005). Biochemistry (3 izd.). Wiley. ISBN 9780471193500. 
• Jahn, G.C.; D.W. Hall; S.G. Zam (1986). „A comparison of the life cycles of two Amblyospora (Microspora: Amblyosporidae) in the mosquitoes Culex salinarius and Culex tarsalis Coquillett”. J. Florida Anti-Mosquito Assoc. 57: 24—27. 
• Khattak, M.N.; R.C. Matthews (1993). „Genetic relatedness of Bordetella species as determined by macrorestriction digests resolved by pulsed-field gel electrophoresis”. Int. J. Syst. Bacteriol. 43 (4): 659—64. PMID 8240949. doi:10.1099/00207713-43-4-659. 
• Barz, D.P.J.; Ehrhard, P. (2005). „Model and verification of electrokinetic flow and transport in a micro-electrophoresis device”. Lab Chip. 5 (9): 949—958. PMID 16100579. doi:10.1039/b503696h. 
• Shim, J.; Dutta, P.; C.F. Ivory (2007). „Modeling and simulation of IEF in 2-D microgeometries”. Electrophoresis. 28 (4): 527—586. PMID 17253629. S2CID 23274096. doi:10.1002/elps.200600402. 

Spoljašnje veze

• List of relative mobilities