Полимеразна ланчана реакција

Из Википедије, слободне енциклопедије

Реакција ланчаног умножавања (енгл. Polymerase Chain Reaction - PCR) је метода којом се умножава молекул ДНК. Метода омогућава стварање великог броја копија циљне ДНК секвенце користећи малу почетну количину ДНК узорка. Полимеразна ланчана реакција се често користи у медицинским и биолошким лабораторијама и има примену у детекцији наследних болести, идентификацији генетског отиска, дијагнози инфективних болести, клонирању гена и тестирању очинства.

Историја[уреди]

Методу је створио и разрадио Кери Малис децембра 1983. За ово откриће је 1993. добио Нобелову награду за хемију, седам година након објављивања првобитних идеја о методи. Малисова замисао је била да развије процес помоћу којег би се вештачким путем увећавао број молекула ДНК у циклусима репликације омогућеним ензимм ДНК полимеразе.

ДНК полимераза се природно јавља у живим организмима, у којим има функцију да копира ДНК када се ћелија дели током митозе и мејозе. Полимераза копира тако што се веже на један, од два полинуклеотидна ланца које чине ДНК, и ствара ланац комплементаран оригиналу. У Мулисовој првобитној методи ензим је коришћен у контролисаном окружењу ван организма. Два полинуклеотидна ланца ДНК који су спирално увијени један око другог би се прво раздвојили грејањем молекула до 96°С. Међутим при овој температури ензим који је у оно време коришћен бивао је уништен, те је ензим морао бити поново додат након сваког циклуса. Мулисова првобитна замисао је била веома неефикасна, јер је захтевала пуно времена, огромне количине ДНК полимеразе и сталну пажњу током целог процеса.

PCR машина

Касније, оригинална метода ПЛР (PCR) је значајно побољшана употребом ДНК полимеразе нађене код термофилних бактерија које живе у гејзирима на температурама од преко 110°С. ДНК полимераза узета од оваквих организама је довољно стабилна при високим температурама и не долази до уништења када се користи током ПЛР процеса. Како није било више потребе додавати нове ензиме ДНК полимеразе након сваког циклуса да замени ензиме уништене температуром, цео процес копирања ДНК молекула је постао једноставнији и бржи.

ПЛР у пракси[уреди]

ПЛР ce користи за копирање кратког унапред одређеног дела молекула ДНК. Копирани молекул може у себи садржати један или више независних целина а може представљати и само фрагмент једне целине. PCR процес може да копира само кратке ДНК фрагменте, обично до 10 кб (кб= кило, 1000 парова база). Различити молекуларни протоколи могу да копирају фрагменте и до 40 кб, мада је и та величина мања од хромозалног ДНК молекула еукариотске ћелије, на пример, људска ћелија садржи око три милијарде нуклеотида.

Да би реакција била могућа потребне су следеће компоненте:

  • ДНК молекул који ће служити као образац за копирање комплементарног ланца
  • Два прајмера који обележавају почетак и крај оног дела ланца који се синтетише
  • Ензим ДНК полимераза, који врши само копирање
  • Нуклеотиди, основни елементи од којих се ДНК гради
  • Одговарајући пуфер са обавезним садржајем магхезијум-хлорида
  • Понекад садржи и интеркалационе боје (LCGreen, SYBR green) на основу којих се врши мелтинг анализа добијеног узорка

PCR реакција је могућа у посебном уређају. Уређај циклично хлади и греје претходно описане реагенте по тачно претходно утврженом протоколу. Цијене урежаја за Полимеразну ланчану реакцију зависно од жељених перформанси варирају од 2000$ до 50,000$ за истраживачке сврхе.

Кораци реакције[уреди]

Кораци реакције и продукција четири нова ДНК молекула од само једног молекула

PCR реакција се састоји од серије циклуса. Број циклуса који се морају извршити зависи од количине иницијалне ДНК масе од које почињемо. Обично се ПЛР успешно обавља било где између 20'45 циклуса.

Сваки циклус се састоји од три корака:

  1. ДНК молекул се прво загреје до 94-96°С како би се два ланца која су претходно спојена водоничним везама раздвојили. Овај корак се назива денатуризација, и раскида водоничне везе. Сама денатуризација је функција процента GC парова у односу на укупан број парова у секвенци, како и њиховог распореда унутар саме секвенце. Што је већи удео то је виша температура на којој долази до раздвајања низова. Ово се објашњава постојањем три водоничне везе између GC у поређењу са две у AT паровима. Због термичке масе-капацитета уређаја пракса је да се ови кораци врше по два минута пошто тек након тог времена можемо засигурно да кажемо да је та температура достигнута. Иначе са новијим уређајима времена од 1с су успјешно коришћене.
  1. Када се ланци ДНК молекула раздвоје, температура се снизи како би се прајмери самостално везали на оба раздвојена ланца. Прајмери обично у секвенци имају по двадесетак нуклеотида па навише. Овај број омогућава специфичност везе, тј. да ће се прајмери везати на жељену локацију. Температура сходно томе зависи од дужине и нуклеотидног састава прајмера, и обично је око 5°С испод њихове тачке топљења (45-60°С). Превисока температура може да онемогући везивање прајмера на ДНК, прениска надовезивање на више одредишта, а недостатак почетне количине ДНК да се надовежу сами на себе стварајући прајмер-дајмер формацију. Овај корак траје најкраће од свих и не би требало да буде дужи (у најгорем случају) од 30 секунди.
  1. И на крају, ДНК полимераза мора да попуни празнине на ланцима, тако што почне од почетног прајмера и иде дуж целог ДНК молекула. Овај корак се назива елонгација. Температура елонгације зависи од ензима ДНК полимеразе који се употребљава. Зависно од ензима и његове брзине, она је обично 10-30 базних парова у секунди, груба процена која би требала да буде задовољавајућа била би нпр. - за 400бп елонгација у трајању од 15-40 секунди.

Референце[уреди]

Литература[уреди]

  • Molecular cloning [A lab manual] Sambrook and Russell, 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001.
  • Mullis, Kary, Dancing in the Minefield, ISBN 0-679-77400-9.


Спољашње везе[уреди]