Imunoesej

S Vikipedije, slobodne enciklopedije
Imunoesej
Ilustracija osnovnih komponenti imunološkog testa, koji uključuje analit (zeleno), antitelo (crno) i oznaku koja se može detektovati (žuta)
MeSHD007118

Imunoesej, imunoanaliza ili imunodijagnostika je skup laboratorijskih analitičkih imunohemijskih tehnika koje imaju zajedničku primenu za analizu imunih kompleksa, nastalih konjugacijom antitela i antigena, kao referenci za kvantifikaciju specifičnog analita (supstance koja se analizira), koji može biti antitelo (At) ili antigen (Ag). Koristi se za merenje i posmatranje molekula kao markera koji su deo reakcije sa imunološkim kompleksom u hemijskom ili imunološkom testu.

Ovi biohemijski testovi mere prisustvo ili koncentraciju makromolekula ili malih molekula u rastvoru korišćenjem antitela (obično) ili antigena (ponekad). Molekul otkriven imunotestom se često naziva "analit" i u mnogim slučajevima je protein, iako može biti i druge vrste molekula, različitih veličina i tipova, sve dok se ne razviju odgovarajuća antitela koja imaju odgovarajuća svojstva za testiranje. Analize u biološkim tečnostima, kao što su serum ili urin, često se izvode uz merenja u imunotestovima u medicinske i istraživačke svrhe.

Istorija[uredi | uredi izvor]

Istraživanje antigenosti malih molekula koje je sproveo Karl Landštajner tokom 1917. godine dalo je okvir za razvoj imunoloških testova za detekciju jedinjenja male molekulske težine. Karl Landštajner je otkrio da su novouvedene grupe promenile specifičnost originalnog proteina nosača, koji sami po sebi nisu bile imunogene. Njegov glavni nalaz se odnosio na izuzetnu specifičnost antiseruma, što su pokazale njegove klasične studije sa L- , D- i mezo-vinskom kiselinom i m -aminobenzoatom.

Prve kompetitivne testove vezivanja koristeći radioaktivno obeležene ligande razvili su Berson i Jalou 1959. godine. Od tada, imunotestovi se primenjuju na širokom spektru naučnih disciplina, uključujući endokrinologiju, biomedicinsku i kliničku hemiju, što je olakšalo rad pojednostavljivanjem formata testova, dostupnošću elektronskih instrumenata i razvoj monoklonalne tehnologije od strane Kohlera i Milsteina 1975. godine.

Primena imunoanaliza u analitičkoj hemiji, posebno u analizi zagađivača hrane, počela je tek u poslednje tri decenije kada je metoda sve više prepoznata kao moćno analitičko sredstvo. Eako je u periodu od 1995–2017. godine, razvijen širok spektar imunoanaliza koje obezbeđuju kvantitativno, semikvantitativno ili kvalitativno otkrivanje analita. Precizno otkrivanje analita u ranoj fazi je suštinski zahtev za sva bioanalitička podešavanja za efikasno praćenje i upravljanje kvalitetom biofarmaceutskih lekova, hrane i životne sredine. Još je važnije efikasno dijagnostikovati, pratiti i upravljati zdravljem pacijenata.

Osnovne informacije[uredi | uredi izvor]

Imunološki testovi su testovi koji otkrivaju prisustvo specifičnog molekula u uzorku korišćenjem reakcija vezivanja antitelo-antigen. Antitela se vezuju za specifičnu strukturu određenog antigena, čineći imunotestove visoko specifičnim: antitelo će se vezati samo za specifičnu strukturu određenog antigena. Ovo čini antitela efikasnim reagensima za otkrivanje ciljnih molekula. Kao rezultat toga, imunotestovi su osnovno sredstvo za bolnice, istraživanja u oblasti nauka o životu i industrijskim laboratorijama. Imunološki testovi dolaze u nizu formata i mogu se koristiti za procenu bolesti, praćenje proteina i otkrivanje kontaminacije životne sredine.

Imunološki testovi dolaze u mnogo različitih formata i varijacija. Mogu se izvoditi u više koraka uz dodavanje reagenasa i ispiranje ili odvajanje na različitim tačkama testa. Višestepeni testovi se često nazivaju separacionim imunoesejima ili heterogeni imunoeseji. Neki imunološki testovi se mogu izvesti jednostavnim mešanjem reagensa i uzorka i fizičkim merenjem. Takvi testovi se nazivaju homogeni ili, ređe, nediferencirani imunološki testovi.

Tehnike se zasnivaju na visokoj specifičnosti i afinitetu antitela za njihove specifične antigene, a koriste se monoklonska antitela (dobijena u laboratoriji) ili poliklonalni serumi (dobijeni od životinja). Pri tome trebalo bi imati u vidu da su monoklonska antitela specifičnija. Visoka osetljivost i specifičnost metode omogućava kvantifikaciju jedinjenja prisutnih u organskim tečnostima u smanjenoj koncentraciji, reda nanograma/ml ili pikograma/ml.

Razvoj imunoeseja imao je veliki uticaj u oblasti medicinske dijagnostike korišćenjem laboratorijskih testova ili kliničke hemije.

Jedna od ključnih prednosti imunoeseja je brzina analize. U instrumentalnim metodama, može biti potrebno opsežno čišćenje uzorka da bi se uklonile smetnje i to često može biti korak koji određuje stopu u analizi ostataka. Mukotrpna priprema uzorka potrebna za instrumentalnu analizu ograničava njegovu primenu u okolnostima kada je potreban veliki broj analiza, iako stvarno vreme za svaku pojedinačnu analizu na instrumentu može biti uporedivo za kratko vreme. Imunološki testovi imaju kapacitet za visoku propusnost i brojni uzorci se mogu analizirati istovremeno, što značajno smanjujući prosečno analitičko vreme. Kao primer, u donjoj tabeli dato je poređenje instrumentalnih metoda i imunotestova na aflatoksine. Poređenje različitih tehnika za analizu zagađivača hrane

Poređenje različitih tehnika za analizu zagađivača hrane
Mikotoksin Minikolona[a] TLC HPLC IAC ELIZA
Granica detekcije (ng/g) 5 5 <  1 metoda zavisna 1-5
Čišćenje po uzorku (min) 60-120 60-120 60-120 10-30 10-30
Detekcija po uzorku (min) 30 120-360 120 15-30 10
Kvantifikacija po uzorku (min) 1-5 10 30 5-30 1-5
Ukupno vreme (min) 151 - 155 490 270 45 – 90 15 - 50

Vrste imunoeseja[uredi | uredi izvor]

Princip imunološkog testa zasniva se na nadmetanju između fiksne količine obeleženog analita i promenljive količine neobeleženog uzorka analita za vezivanje ograničenog broja vezivnih mesta antitela koje je specifično podignuto protiv analita. Ove metode se mogu koristiti za detekciju ciljnog molekula: kvantitativno, semikvantitativno ili kvalitativno.

Postoje najmanje četiri glavna tipa imunoeseja, sa podtipovima svakog glavnog formata, a nove tehnike se stalno razvijaju. Obično se imunotestovi dele na:

Testove koji koriste etikete

Testove koji ne koriste etikete – i nazivaju se imunoeseji „bez oznaka“. Ova tehnologija je omogućila razvoj minijaturnih uređaja za imunotestiranje bez etiketa (LFIA). Ovi uređaji su funkcionalizovani antitelima za hvatanje i imaju rezonantno stanje svetlosti. Ova talasna dužina rezonance će biti pomerena reakcijom između antitela za hvatanje i ciljnog antigena zbog promene indeksa prelamanja. Merenje pomeranja talasne dužine rezonance daje očitavanje događaja vezivanja. Testovi bez obeležavanja stoga omogućavaju detekciju vezivanja antigen-antitelo bez upotrebe dodatne oznake, što rezultuje povećanom osetljivošću testa i skraćenim radnim vremenom.

Obeleženi imunoeseji se sastoje od analita (ciljnog antigena koji se meri), antitela i oznake koja omogućava detekciju molekula. Pet najčešće korišćenih tipova imunotestova su:

  • Radioimunotest (RIA)
  • Enzimski imunoesej (EIA) ili enzimski imunosorbentni test (ELISA)
  • Fluoroimunoesej (FPIA)
  • Hemiluminiscentni imunotest (CLIA)
  • Imunološki test brojanje čestica (CIA)

Radioimunotest (RIA)[uredi | uredi izvor]

Radioimunotestovi koriste radioizotop kao oznaku za kvantifikaciju hormona, lekova i virusnih antigena . Poznata koncentracija radioaktivno obeleženog antigena se inkubira sa fiksnom koncentracijom antitela specifičnog za taj antigen. Ovaj radioaktivno obeleženi kompleks antigen-antitelo se zatim meša sa biološkim uzorkom koji sadrži nepoznatu koncentraciju istog antigena.

U principu, ako je koncentracija antigena uzorka viša od radioaktivno obeleženog antigena, antigen uzorka će vezati ograničen broj mesta vezivanja antitela zamenom radioaktivno obeleženog antigena. Zatim se meri radioaktivnost ovih slobodnih (nevezanih za antitelo) radioaktivno obeleženih antigena; što je direktno proporcionalno koncentraciji neobeleženog antigena prisutnog u biološkom uzorku.

Međutim, kratko vreme poluraspada radioizotopa, kao i opasnosti po zdravlje povezane sa njihovom upotrebom, značajno ograničavaju primenu ove metode u mnogim laboratorijama.

Enzimski imunosorbentni test (ELISA)[uredi | uredi izvor]

ELISA test

U ELISA testu, enzim je vezan za antitelo koje je specifično podignuto protiv antigena od interesa. Biološkim uzorcima koji sadrže ciljni antigen se dozvoljava da se vežu za enzimom obeleženo antitelo i reakcija se vizuelizuje korišćenjem supstrata specifičnog za enzim koji se dodaje u reakcionu smešu. Supstrat specifičan za enzim se vezuje za enzim vezan za antitelo, stvarajući obojeni proizvod koji se može detektovati korišćenjem hromogenih ili hemiluminiscentnih tehnika snimanja.

ELISA ima visoku specifičnost i osetljivost, tako da se često koristi za visokopropusni skrining antitela ili lekova.

Fluoroimunoeseji (FPIA)[uredi | uredi izvor]

Vidi još: Fluorescentni polarizacioni imunoesej
Fluorescentni polarizacioni imunoesej (FPIA) test

Fluorescentni polarizacioni imunoesej (FPIA) je klasa in vitro biohemijskog testa koji se koristi za brzo otkrivanje antitela ili antigena u uzorku. FPIA je kompetitivni homogeni test, koji se sastoji od jednostavne metode pripreme i očitavanja, bez zahteva za korake razdvajanja ili pranja.[1]

U FPIA testu fluorescentne sonde se koriste za obeležavanje antitela. Biološki uzorci koji sadrže antigen od interesa se inkubiraju sa fluorescentno obeleženim antitelom. Intenzitet fluorescencije dobijenog kompleksa antigen-antitelo se meri da bi se kvantifikovao ciljni antigen.[1]

Hemiluminiscencijski imunoeseji (CLIA)[uredi | uredi izvor]

Hemiluminiscentni imunoesej (CLIA) je tehnika imunoeseja gde je oznaka, odnosno pravi „indikator“ analitičke reakcije, luminiscentni molekul. Uopšteno govoreći, luminiscencija je emisija vidljivog ili skoro vidljivog ( λ  = 300–800 nm) zračenja koje se generiše kada elektron pređe iz pobuđenog stanja u osnovno stanje. Rezultujuća potencijalna energija u atomu se oslobađa u obliku svetlosti. U spektrofotometriji, luminiscencija ima prednost u odnosu na apsorpciju u tome što je prva apsolutna mera, dok je druga relativna.[2]

Hemiluminiscentni test je heterogena metoda koja se više koristi. Hemiluminiscentne metode mogu biti direktne — korišćenjem markera luminofora — ili indirektne — korišćenjem markera enzima. Bilo koji metod može biti konkurentan ili nekonkurentan.

U direktnim hemiluminiscentnim metodama, luminoforni markeri koji se koriste su akridinijum i rutenijum estri, dok su enzimski markeri koji se koriste u indirektnim metodama alkalna fosfataza sa supstratom adamantil 1, 2-dioksetan aril fosfata (AMPPD) i ren peroksidaza ili njegov derivat luminola.[2]

Sintetički molekuli kao što su AMPPD i derivati baznih molekula izoluminola su stabilniji u poređenju sa drugim luminiscentnim markerima i rezultiraju emisijom svetlosti sa karakteristično povišenim kvantnim prinosom. Aktivacija ovih supstrata zahteva hemijske ili enzimske reakcije povezane sa imunološkom reakcijom. Na primer, upotreba luminola i derivata izoluminola kao hemiluminiscentnih oznaka zavisi od spajanja imunotesta sa enzimskim reakcijama katalizovanim peroksidazom. Dodavanje pojačivača (npr. ferocijanida, metalnih jona) dodatno pojačava elektronsku aktivaciju, što na kraju dovodi do izuzetno povišene analitičke osetljivosti (mol -16 po litru), koja je svakako bolja od onih koje se mogu postići drugim metodama imunotestiranja kao što je RIA, imunoenzimska (ELISA) i fluoroimunoenzimske (FEIA) metode itd.

Glavna prednost ove metode je u tome što se očitavanje može povećati korišćenjem pojačivača, koji omogućavaju da se reakcija nastavi duže vreme bez smanjenja intenziteta signala. Zbog svoje visoke osetljivosti i specifičnosti, CLIA se koristi u nizu različitih oblasti, uključujući:

  • praćenje životne sredine,
  • dijagnozu bolesti,
  • nauke o životu,
  • bezbednost hrane.

Novije tehnike, kao što je CLIA zasnovana na magnetnim perlama, takođe su proširile svoj potencijal. Na primer, testovi hemiluminiscencije koji se aktiviraju magnetom su razvijeni da bi se otkrilo prisustvo Zika virusa u uzorcima pacijenata.

Imunološki test brojanje čestica (CIA)[uredi | uredi izvor]

Imunološki test brojanja (CIA) je primena tehnologije brojanja čestica na serološke testove.[3] Čestice lateksa se aglutiniraju antitelima ili antigenima od interesa i kvantifikuju se rasejanom laserskom svetlošću dok prolaze kroz kontrolisan tok omotača, koji se takođe koristi u protočnoj citometriji. Slična metoda je imunotest sa brojanjem čestica, u kome se neaglutinirane čestice broje uz pomoć instrumentacije.[4] Prijavljene primene ovih metoda, od kojih većina koristi uzorke seruma, uključuju detekciju antigena ili antitela virusa hepatitisa B (HBV),[4] antitela protiv leukemije T-ćelija,[3] antitoksoplazma antitela,[5] kotinina u urinu,[6] hormone[7] i proteine akutne faze u serumu.

Prednosti CIA u poređenju sa tradicionalnim enzimskim metodama uključuju vreme reakcije od samo 15 minuta, visoku propusnost i male zapremine uzorka.

Kako odabrati imunotest?[uredi | uredi izvor]

Veliki broj tipova i podtipova imunotestova može učiniti izbor pravog imunoeseja za istraživača izazovnim. Evo nekoliko stvari koje treba uzeti u obzir prilikom donošenja odluke:

Koja je osetljivost potrebna

Ovo je određeno koncentracijom antigena sa kojima će se raditi: niske koncentracije zahtevaju veću osetljivost da bi se osigurala detekcija. Takođe trebalo bi uzeti u obzir zahteve za protok i cenu.

Koje parove antitelo-antigen treba testirati

U tom smislu pre primene imunotesta trebalo bi proverite njihovu dostupnost komercijalno, ili alternativno da bi se proizveo reagens u laboratoriji.

Koja se površina ili okruženje želi koristiti

Na primer, bira se onaj test koji može vezati antitela ili antigene za čvrstu ploču ili magnetnu kuglicu, u zavisnosti od toga koji cilj treba da se posmatra.

Napomene[uredi | uredi izvor]

  1. ^ Potreba malih hromatografskih kolona (minikolona) za detekciju aflatoksina u hrani ili ekstraktima hrane za životinje uvedena je 1968. Od tada su razvijene mnoge različite analitičke metode za aflatoksin koje uključuju korak detekcije u mini koloni. Četiri od njih su usvojene kao zvanične procedure Udruženja zvaničnih analitičkih hemičara (AOAC).

Izvori[uredi | uredi izvor]

  1. ^ a b Jameson, David; Croney, John (2003-05-01). „Fluorescence Polarization: Past, Present and Future”. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 6 (3): 167—176. ISSN 1386-2073. doi:10.2174/138620703106298347.
  2. ^ a b Cinquanta, Luigi; Fontana, Desré Ethel; Bizzaro, Nicola (2017-06-24). „Chemiluminescent immunoassay technology: what does it change in autoantibody detection?”. Auto-Immunity Highlights. 8 (1): 9. ISSN 2038-0305. PMC 5483212 Slobodan pristup. PMID 28647912. doi:10.1007/s13317-017-0097-2. 
  3. ^ a b Yamaguchi, Kazunari; Yonemura, Yuji; Okabe, Hiroaki; Takahama, Yoichi; Nagai, Shinya; Yamaguchi, Haruki; Hirai, Kojiro (2003-02-01). „Detection of Anti-Human T-Lymphotropic Virus Type I Antibody in Whole Blood by a Novel Counting Immunoassay”. Clinical Chemistry. 49 (2): 275—280. ISSN 0009-9147. doi:10.1373/49.2.275. 
  4. ^ a b Galanti, Laurence M.; Cornu, Chantai; Masson, Pierre L.; Robert, Annie R.; Becheanu, Dora; Lamy, Monique E.; Cambiaso, César L. (1991). „Assay of anti-HBs antibodies using a recombinant antigen and latex particle counting: comparison with five commercial tests”. Journal of Virological Methods. 32 (2-3): 221—231. ISSN 0166-0934. doi:10.1016/0166-0934(91)90053-3. 
  5. ^ Galanti, L.M; Dell'Omo, J; Wanet, B; Guarin, J.-L; Jamart, J; Garrino, M-G; Masson, P.L; Cambiaso, C.L (1997). „Particle counting assay for anti-toxoplasma IgG antibodies. Comparison with four automated commercial enzyme-linked immunoassays”. Journal of Immunological Methods. 207 (2): 195—201. ISSN 0022-1759. doi:10.1016/s0022-1759(97)00120-8. 
  6. ^ Galanti, Laurence M.; Dell'Omo, Juliette; Vanbeckbergen, Danielle; Dubois, Pierre; Masson, Pierre L.; Cambiaso, César L. (1999-07-01). „Particle Counting Immunoassay for Urinary Cotinine. Comparison with Chromatography, Enzyme-linked Immunoassay and Fluorescence Polarization Immunoassay”. cclm. 37 (7): 729—734. ISSN 1434-6621. doi:10.1515/cclm.1999.112. 
  7. ^ Halflants, M.; Tasiaux, N.; Van Krieken, L.; De Hertogh, R.; Collet-Cassart, D. (1990). „Particle counting immunoassay of choriogonadotropin using monoclonal antibodies”. Journal of Immunological Methods. 134 (2): 171—175. ISSN 0022-1759. doi:10.1016/0022-1759(90)90378-9. 

Spoljašnje veze[uredi | uredi izvor]

Molimo Vas, obratite pažnju na važno upozorenje
u vezi sa temama iz oblasti medicine (zdravlja).
Preuzeto iz „https://sr.wikipedia.org/w/index.php?title=Имуноесеј&oldid=27442916”