Korisnik:Monka005/Southern blot

S Vikipedije, slobodne enciklopedije
Agarozni gel
Posuda sa sabijenim papirnim salvetama , membranom od nitroceluloze ili najlona, gelom, rastvorom soli i staklenom pločom.
Southern blot membrana nakon hibridizacije i ispiranja.
Agarozni gel pod ultraljubičastim osvetljenjem nakon primene metode Southern blot .
Southern blot autoradiogram.

Southern blot je metoda koja se koristi u molekularnoj biologiji za otkrivanje specifične sekvence DNK u uzorcima DNK. Southern blot kombinuje prenos fragmenata DNK koji su razdvojeni gel-elektroforezom na filter membranu i naknadno detektovanje fragmenata hibridizacijom sa obeleženim probama.

Metoda je dobila ime po britanskom biologu Edvinu Sadernu (Edwin Southern) koji ju je prvi put objavio 1975. [1] Ostale metode blotiranja ( Vestern blot (Western blot), [2] Northern blot, Eastern blot ili Southwestern blot ) koriste slične principe, ali koristeći RNK ili protein, imenovane su po analogiji sa Southern blot. [3]

Metod[uredi | uredi izvor]

  1. Restriktivne endonukleze koriste se za sečenje lanca DNK velike molekulske mase na manje fragmente.
  2. Elektroforeza DNK fragmenata na agaroznom gelu kako bi se fragmenti razdvojili po veličini.
  3. Ako su neki fragmenti DNK veći od 15 kb, tada pre analize gel može biti tretiran kiselinom, kao što je razblažena HCl . Ovo dovodi do delimične hidrolize molekula DNK uzrokovanom depurinacijom i na taj način omogućava efikasniji prenos više manjih fragmenata molekula DNK sa gela na membranu.
  4. Ako se koriste metode alkalnog prenosa, DNK gel se stavlja u alkalni rastvor (koji obično sadrži natrijum hidroksid ) da bi se denaturisala dvolančana DNK. Denaturacija u alkalnom okruženju može poboljšati vezivanje negativno naelektrisanih ostataka timina DNK za pozitivno naelektrisane amino grupe membrane, razdvajajući dvolančanu DNK na jednolančane DNK molekule potrebne za kasniju hibridizaciju sa probom (vidi dole), takođe uništava svaku zaostalu RNK koja može još uvek su prisutna u DNK. Izbor alkalnih umesto neutralnih metoda prenosa, međutim, često je empirijski i može d[ <span title="This claim needs references to reliable sources. (February 2009)">цитат је потребан</span> ][ <span title="This claim needs references to reliable sources. (February 2009)">цитат је потребан</span> ]ovesti do identičnih rezultata. [traži se izvor]
  5. Na vrh (ili ispod, u zavisnosti od pravca prenošenja) gela se postavlja sloj nitrocelulozne (ili alternativno najlonske ) membrane . Pritisak se nanosi ravnomerno na gel (bilo usisavanjem, bilo postavljanjem snopa papirnih peškira i težine na membranu i gel), kako bi se osigurao dobar i ravnomerni kontakt gela i membrane. Ako se prenosi usisavanjem, koristi se 20X SSC pufer da se osigura zaptivanje i spreči sušenje gela. Prenos pufera kapilarnim delovanjem iz regiona visokog vodnog potencijala u područje niskog vodnog potencijala (obično filter papir) se zatim koristi za premeštanje DNK iz gela na membranu; jonske veze vežu DNK na membranu zbog negativnog naelektrisanja DNK i pozitivnog naelektrisanja membrane.
  6. Membrana se zatim peče u vakuumu ili običnoj peći na 80 °C tokom 2 sata (standardni uslovi; nitrocelulozna ili najlonska membrana) ili izloženi ultraljubičastom zračenju (najlonska membrana) za trajno vezivanje prenesene DNK na membranu.
  7. Membrana je zatim izložena probi za hibridizaciju - jedinstven fragment DNK sa specifičnom sekvencom čija se prisutnost u ciljnoj DNK treba odrediti. DNK proba je obeležena tako da se može detektovati, obično uključivanjem radioaktivnosti ili obeležavanjem molekula fluorescentnim ili hromogenim bojama . U nekim slučajevima proba za hibridizaciju može da se napravi od RNK, a ne iz DNK. Da bi se osigurala specifičnost vezivanja probe za DNK uzorka, najčešće metode hibridizacije koriste DNK sperme lososa ili haringe za blokiranje površine membrane i ciljne DNK, dejonizovani formamid i deterdžente kao što je SDS da bi se smanjilo nespecifično vezivanje proba.
  8. Posle hibridizacije, višak probe se ispere sa membrane (obično se koristi SSC pufer ). Obrazac hibridizacije se na radiografskom filmu vizuelno prikazuje autoradiografijom u slučaju radioaktivne ili fluorescentne probe ili razvijanjem boje na membrani ako se koristi hromogena metoda detekcije.

Rezultat[uredi | uredi izvor]

Hibridizacija probe na određeni fragment DNK na membrani filtera ukazuje da ovaj fragment sadrži DNK sekvencu koja je komplementarna probi. Korak prenosa DNK sa gela za elektroforezu na membranu omogućava lako vezivanje obeležene hibridizacione probe na frakcionisanu DNK. Takođe omogućava fiksaciju hibrida ciljna DNK-proba, koja je potrebna za analizu autoradiografijom ili drugim metodama detekcije.

Southern blot izvršen restrikcionom digestijom genomske DNK može se koristiti za određivanje broja sekvenci (npr.broja kopija gena) u genomu . Proba koja se hibridizira samo na jedan DNK segment koji nije presečen restrikcijskim enzimom će proizvesti jednu traku na Southern blot-u, dok će se verovatno opažati više opsega kada proba hibridizira na nekoliko vrlo sličnih sekvenci (npr.Onih koji može biti rezultat dupliranja sekvenci).

Modifikacija uslova hibridizacije (na primer, povećanje temperature hibridizacije ili smanjenje koncentracije soli) može se koristiti za povećanje specifičnosti i smanjenje hibridizacije probe na sekvencije manje od 100%.

Primene[uredi | uredi izvor]

Southern blot se može koristiti za kloniranje zasnovano na homologiji na osnovu aminokiselinske sekvence proteinskog proizvoda ciljnog gena. Oligonukleotidi su dizajnirani tako da su slični ciljnoj sekvenci. Oligonukleotidi su hemijski sintetisani, radioaktivno obeleženi i koriste se za pretraživanje DNK biblioteke ili druge kolekcije kloniranih fragmenata DNK. Sekvence koje se hibridiziraju probom za hibridizaciju dalje se analiziraju, na primer, da bi se dobila sekvenca ciljnog gena.

Southern blot se takođe može koristiti za identifikaciju metilovanih mesta u određenim genima. Posebno su korisne restrikcione nukleaze MspI i HpaII, koje obe prepoznaju i odvajaju se u istom nizu. Međutim, HpaII zahteva da se metilira citozin unutar tog mesta, dok MspI seče samo nemetilovanu DNK. Stoga će svako metilovano mesto unutar sekvence analizirane određenom probom seći HpaII, a ne MspI . [4]

Vidi još[uredi | uredi izvor]

Reference[uredi | uredi izvor]

  1. ^ Southern, Edwin Mellor (5. 11. 1975). „Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis”. Journal of Molecular Biology. 98 (3): 503—517. ISSN 0022-2836. PMID 1195397. doi:10.1016/S0022-2836(75)80083-0. 
  2. ^ Towbin; Staehelin, T; Gordon, J; et al. (1979). „Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications”. PNAS. 76 (9): 4350—4. PMC 411572 Slobodan pristup. PMID 388439. doi:10.1073/pnas.76.9.4350. 
  3. ^ Burnette, W. Neal (april 1981). „Western Blotting: Electrophoretic Transfer of Proteins from Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels to Unmodified Nitrocellulose and Radiographic Detection with Antibody and Radioiodinated Protein A”. Analytical Biochemistry. 112 (2): 195—203. ISSN 0003-2697. PMID 6266278. doi:10.1016/0003-2697(81)90281-5. 
  4. ^ Biochemistry 3rd Edition, Matthews, Van Holde et al, Addison Wesley Publishing, pg 977

Spoljašnje veze[uredi | uredi izvor]

[[Категорија:Методи у молекуларној биологији]]

Preuzeto iz „https://sr.wikipedia.org/w/index.php?title=Корисник:Monka005/Southern_blot&oldid=22995081”