Reakcija lančane polimerizacije

S Vikipedije, slobodne enciklopedije

Reakcija lančanog umnožavanja (engl. polymerase chain reaction - PCR) je metoda kojom se umnožava molekul DNK. Metoda omogućava stvaranje velikog broja kopija ciljne DNK sekvence koristeći malu početnu količinu DNK uzorka. Polimerazna lančana reakcija se često koristi u medicinskim i biološkim laboratorijama i ima primenu u detekciji naslednih bolesti, identifikaciji genetskog otiska, dijagnozi infektivnih bolesti, kloniranju gena i testiranju očinstva. [1][2]

Ova tehnika je doslovno izazvala revoluciju u oblasti molekulske genetike i biologije generalno. Polazna količina DNK, koja je decenijama predstavljala ograničavajući faktor u istraživanjima, svela se na potrebu prisustva samo jednog dobro očuvanog molekule, a mukotrpne procedure izolacije i prečišćavanja delova genoma postale su jednostavnije. Pred istraživačima su se naglo otvorile nove mogućnosti. Pored toga, gotovo da ne postoji društvena delatnost koju ova tehnika nije direktno ili indirektno dotakla i zauvek izmenila. Glavni „krivci” za ovakvu pometnju su Keri Malis i njegovi saradnici iz Odela za humanu genetiku Korporacije Cetus. Oni su u časopisu Nauka 1985. godine objavili rad u kojem prvi put opisuju tehniku specifičnog umnožavanja fragmenta DNK in vitro katalizovanog enzimom DNK polimeraza poreklom iz bakterije Ešerihija koli.[3][4][5][6][7][8] U istom časopisu je 1988. godine isti tim naučnika objavio rad u kome umesto navedene polimeraze E. koli uvode termostabilnu DNK polimerazu I[9][10] izolovanu iz bakterije Thermus aquaticus (Taq).[11][12] Uprkos brojnim modifikacijama, raznovrsnim primenama i automatizaciji procesa lančane sinteze polimerazom, osnovne odrednice ove tehnike utemeljene 1985. i 1988. godine nisu se značajnije izmenile.[13]

Osnovne premise na kojim se zasniva PCR su sledeće.

  • U nativnom stanju DNK je dvostruki heliks koji se, sastoji se od dva antiparalelna polinukleotidna lanca međusobno povezana vodoničnim vezama;
  • nukleotidi jednog polinukleotidnog lanca su međusobno povezani kovalentnom vezom između dezoksiriboze jednog nukleotida i fosfatne grupe susednog nukleotida, a vodonične veze koje održavaju dva polinukleotidna lanca zajedno uvek se formiraju između komplementarnih baza, tj. adenin (A) se uvek veže za timin (T), a citozin (C) za guanin (G).
  • Vodonične veze su energetski slabe i lako se remete zagrevanjem (denaturacija), dok su kovalentne veze stabilne i pri zagrijavanju se održavaju, a
  • hlađenje dovodi do ponovnog uspostavljanja vodoničnih veza između komplementarnih baza (renaturacija).
  • DNK replikaciju in vivo inicira RNK Pol I sintetišujući kratke RNK sekvence, time kreirajući supstrat za DNK Pol I (slobodnu –OH–grupu dezoksiriboze na 3’–kraju), a
  • na optimalnoj temperaturi, DNK Pol I katalizuje ugradnju slobodnih dezoksiribonukleotid–3–fosfata na postojeći oligonukleotidni lanac sa slobodnom –OH–grupom na 3’–kraju, kada je isti vodoničnim vezama povezan za matricu.

Istorija[uredi | uredi izvor]

PCR mašina

Metodu je stvorio i razradio Keri Malis decembra 1983.[14][15] Za ovo otkriće je 1993. dobio Nobelovu nagradu za hemiju,[16] sedam godina nakon objavljivanja prvobitnih ideja o metodi. Malisova zamisao je bila da razvije proces pomoću kojeg bi se veštačkim putem uvećavao broj molekula DNK u ciklusima replikacije omogućenim enzim DNK polimeraze. DNK polimeraza se prirodno javlja u živim organizmima, u kojim ima funkciju da kopira DNK kada se ćelija deli tokom mitoze i mejoze. Polimeraza kopira tako što se veže na jedan, od dva polinukleotidna lanca koje čine DNK, i stvara lanac komplementaran originalu. U Malisovoj prvobitnoj metodi enzim je korišćen u kontrolisanom okruženju van organizma. Dva polinukleotidna lanca DNK koji su spiralno uvijeni jedan oko drugog bi se prvo razdvojili grejanjem molekula do 96 °C. Međutim pri ovoj temperaturi enzim koji je u ono vreme korišćen bivao je uništen, te je enzim morao biti ponovo dodat nakon svakog ciklusa. Malisova prvobitna zamisao je bila veoma neefikasna, jer je zahtevala puno vremena, ogromne količine DNK polimeraze i stalnu pažnju tokom celog procesa. Kasnije, originalna metoda PLR (PCR) je značajno poboljšana upotrebom DNK polimeraze nađene kod termofilnih bakterija koje žive u gejzirima na temperaturama od preko 110 °C. DNK polimeraza uzeta od ovakvih organizama je dovoljno stabilna pri visokim temperaturama i ne dolazi do uništenja kada se koristi tokom PLR procesa. Kako nije bilo više potrebe dodavati nove enzime DNK polimeraze nakon svakog ciklusa da zameni enzime uništene temperaturom, ceo proces kopiranja DNK molekula je postao jednostavniji i brži.

Pošavši od prvobitne ideje, Malis je pretpostavio da može postići umnožavanje specifičnog dela DNK molekula koji leži između dva regiona čija je sekvenca poznata. Selekcija specifičnog dela DNK molekule postiže se primenom oligonukleotidnih prajmera, kratkih DNK sekvenci (20–30 nukleotida) koje su komplementarne krajevima definisane sekvence. U tipičnoj PCR reakciji učestvuju dva prajmera sintetizirana u 5’→3’–pravcu, tako da se na njihovom 3’–kraju nalazi dezoksiriboza sa slobodnom –OH–grupom i obično se obeležavaju sa F (za napred) i R (za nazad). Na temperaturi od 95 °C pucaju vodonikove veze koje održavaju dvolančanu strukturu molekula čiji se deo umnožava (DNA = matrica) te se ona denaturiše. Spuštanjem temperature stvaraju se uslovi za renaturaciju, ali i za formiranje hibridnih molekula matrica–prajmer. DNK Pol I pronalazi takve hibride i pod odgovarajućim uslovima kataluje vezivanje fosfatne grupe dezoksinukleotid–3–fosfata za 3’–OH–grupu dezoksiriboze prajmera prema konstanti komplementarnosti. Rezultat je sintetisan naspramni lanac komplementaran matrici koji može da posluži kao matrica drugom prajmeru. Ovaj ciklus denaturacije zagrevanjem, renaturacije hlađenjem i sinteze naspramnog lanca može se ponavljati, a svaki novosintetizirani lanac postaje matrica u narednom ciklusu. Takođe, sa porastom broja ciklusa eksponencijalno raste broj molekula specifično umnožavanog dela DNK. Teorijski broj molekula ciljane sekvence koja se sastoji od sekvence prajmera i dela DNK molekula između prajmerskih sekvenci, iznosi 2n (n = broj ciklusa) za svaki molekul DNK matrice. Takođe teoriski, od jednog jedinog molekula se, u 30 ciklusa, može dobiti 230–2*30 = 1.073.741.764 ciljanih fragmenata. Ponavljanje ciklusa može biti efikasno sve dok ne nastane deficit neke od komponenti (prajmera, nukleotid–3–fosfata ili enzima). Zavisno od svrhe reakcije, veličine umnožavanog dela DNK i željene koncentracije, tipična PCR reakcija se odvija u 30–40 ciklusa.

PLR u praksi[uredi | uredi izvor]

PLR ce koristi za kopiranje kratkog unapred određenog dela molekula DNK. Kopirani molekul može u sebi sadržati jedan ili više nezavisnih celina a može predstavljati i samo fragment jedne celine. PCR proces može da kopira samo kratke DNK fragmente, obično do 10 kb (kb= kilo, 1000 parova baza). Različiti molekularni protokoli mogu da kopiraju fragmente i do 40 kb, mada je i ta veličina manja od hromozalnog DNK molekula eukariotske ćelije, na primer, ljudska ćelija sadrži oko tri milijarde nukleotida.

Da bi reakcija bila moguća potrebne su sledeće komponente:

  • DNK molekul koji će služiti kao obrazac za kopiranje komplementarnog lanca
  • Dva prajmera koji obeležavaju početak i kraj onog dela lanca koji se sintetiše
  • Enzim DNK polimeraza, koji vrši samo kopiranje
  • Nukleotidi, osnovni elementi od kojih se DNK gradi
  • Odgovarajući pufer sa obaveznim sadržajem maghezijum-hlorida
  • Ponekad sadrži i interkalacione boje (LCGreen, SYBR green) na osnovu kojih se vrši melting analiza dobijenog uzorka

PCR reakcija je moguća u posebnom uređaju. Uređaj ciklično hladi i greje prethodno opisane reagente po tačno prethodno utvrženom protokolu. Cijene urežaja za Polimeraznu lančanu reakciju zavisno od željenih performansi variraju od 2000$ do 50,000$ za istraživačke svrhe.

Koraci reakcije[uredi | uredi izvor]

Koraci reakcije i produkcija četiri nova DNK molekula od samo jednog molekula

PCR reakcija se sastoji od serije ciklusa. Broj ciklusa koji se moraju izvršiti zavisi od količine inicijalne DNK mase od koje počinjemo. Obično se PLR uspešno obavlja bilo gde između 20'45 ciklusa.

Svaki ciklus se sastoji od tri koraka:

  1. DNK molekul se prvo zagreje do 94-96 °C kako bi se dva lanca koja su prethodno spojena vodoničnim vezama razdvojili. Ovaj korak se naziva denaturizacija, i raskida vodonične veze. Sama denaturizacija je funkcija procenta GC parova u odnosu na ukupan broj parova u sekvenci, kako i njihovog rasporeda unutar same sekvence. Što je veći udeo to je viša temperatura na kojoj dolazi do razdvajanja nizova. Ovo se objašnjava postojanjem tri vodonične veze između GC u poređenju sa dve u AT parovima. Zbog termičke mase-kapaciteta uređaja praksa je da se ovi koraci vrše po dva minuta pošto tek nakon tog vremena možemo zasigurno da kažemo da je ta temperatura dostignuta. Inače sa novijim uređajima vremena od 1s su uspješno korišćene.
  2. Kada se lanci DNK molekula razdvoje, temperatura se snizi kako bi se prajmeri samostalno vezali na oba razdvojena lanca. Prajmeri obično u sekvenci imaju po dvadesetak nukleotida pa naviše. Ovaj broj omogućava specifičnost veze, tj. da će se prajmeri vezati na željenu lokaciju. Temperatura shodno tome zavisi od dužine i nukleotidnog sastava prajmera, i obično je oko 5 °C ispod njihove tačke topljenja (45-60 °C). Previsoka temperatura može da onemogući vezivanje prajmera na DNK, preniska nadovezivanje na više odredišta, a nedostatak početne količine DNK da se nadovežu sami na sebe stvarajući prajmer-dajmer formaciju. Ovaj korak traje najkraće od svih i ne bi trebalo da bude duži (u najgorem slučaju) od 30 sekundi.
  3. I na kraju, DNK polimeraza mora da popuni praznine na lancima, tako što počne od početnog prajmera i ide duž celog DNK molekula. Ovaj korak se naziva elongacija. Temperatura elongacije zavisi od enzima DNK polimeraze koji se upotrebljava. Zavisno od enzima i njegove brzine, ona je obično 10-30 baznih parova u sekundi, gruba procena koja bi trebalo da bude zadovoljavajuća bila bi npr. - za 400bp elongacija u trajanju od 15-40 sekundi.

PCR metoda[uredi | uredi izvor]

Pi-Si-Ar je metoda u molekularnoj genetici koji omogućava selektivno umnožavanje određnog segmenta molekula DNK. Pi-Si-Ar metoda se zasniva na principima replikacije DNK. Da bi se izvršilo umnožavanje odabranog regiona DNK, neophodo je da poznajemo strukturu njegovih graničnih regiona. Na osnovu tih podataka konstruišu se jednolančani nizovi od oko 20 nukleotida — tzv. prajmeri, koji su komplementarni ovim regionima. U Pi-Si-Ar reakciji prajmeri se vezuju za matrične niti DNK i služe DNK polimerazi kao prajmeri za sintezu novih lanaca nukleotida.

U jednom cilkusu umnožavanja mogu se izdvojiti tri osnovne faze:

  1. denaturacija DNK,
  2. komplementarno povezivanje prajmera za jednolančane matrice, i
  3. sinteza novih lanaca.

Svaka faza Pi-Si-Ar reakcije je određna temperaturom na kojoj se odvija i vremenom trajanja. Ciklusi umnožavanja se ponavljaju 25-40 puta, i na taj način se eksponencijalno uvećava broj kopija odabranog segmenta DNK.

Ključni korak u razvoju metode označila je izolacija termostabilne DNK polimeraze, koja može da sačuva efikasnost tokom cikličnih temperaturnih promena. Takav enzim dobijen je iz termofilnog bakterijskog soja Thermus aquaticus, i poznat je kao Taq polimeraza.

U klasičnoj reakcionoj smeši za Pi-Si-Ar nalaze se: DNK koja se analizira, specifični prajmeri, enzim Taq polimeraza, slobodni nukleotidi za sintezu novih lanaca (u vidu dNTP), joni Mg++ i odgovarajući pufer. Za izvođnje Pi-Si-Ar reakcije koriste se automatizovani aparati, u kojima se prema zadatom programu smenjuju temperature pojedinih faza. Na početku svakog ciklusa vrši se denaturacija uzorka DNK na temperaturi od 94-960 °C. Udrugoj fazi — fazi annealing-a ili hibridizacije, par prajmera se specifično vezuje za komplementarne regione DNK, ograničavajuci segment koji treba da bude amplifikovan. Povezivanje prajmera se odvija na temperaturi koja zavisi od njihove sekvence tj. redosleda nukleotida, a iznosi 50-700 °C. Treća faza je faza sinteze DNK, poznata i kao faza ekstenzije. Enzim Taq DNK polimeraza vrši sintezu novih (komplementarnih) lanaca nukleotida, koji se nastavljaju na prajmere u 5’-3’ smeru. Taq polimeraza ostvaruje optimalno dejstvo na 720 °C, pa je to uobičajena temperatura na kojoj se odvija faza ekstenzije; vreme trajanja je određeno veličinom regiona koji se umnožava. Na završetku ove faze dobijaju se dve kopije segmenta DNK koji je ograničen prajmerima. Reakcija se zatim ciklično ponavlja a u svakom novom ciklusu kao matrice služe i novosintetisani molekuli DNK. Nakon 25-40 ciklusa željeni segment DNK je umnožen 104—106 puta, što omogućava njegovo uočavanje posle gel-elektroforeze i bojenja.

Vidi još[uredi | uredi izvor]

Reference[uredi | uredi izvor]

  1. ^ Saiki, R.; Scharf, S.; Faloona, F.; Mullis, K.; Horn, G.; Erlich, H.; Arnheim, N. (1985). „Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia”. Science. 230 (4732): 1350—1354. PMID 2999980. doi:10.1126/science.2999980. 
  2. ^ Saiki, R.; Gelfand, D.; Stoffel, S.; Scharf, S.; Higuchi, R.; Horn, G.; Mullis, K.; Erlich, H. (1988). „Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase”. Science. 239 (4839): 487—491. PMID 2448875. doi:10.1126/science.2448875. 
  3. ^ Bollum FJ (avgust 1960). „Calf thymus polymerase”. The Journal of Biological Chemistry. 235: 2399—403. PMID 13802334. 
  4. ^ Falaschi A, Kornberg A (april 1966). „Biochemical studies of bacterial sporulation. II. Deoxy- ribonucleic acid polymerase in spores of Bacillus subtilis”. The Journal of Biological Chemistry. 241 (7): 1478—82. PMID 4957767. 
  5. ^ Lehman IR, Bessman MJ, Simms ES, Kornberg A (jul 1958). „Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. I. Preparation of substrates and partial purification of an enzyme from Escherichia coli”. The Journal of Biological Chemistry. 233 (1): 163—70. PMID 13563462. 
  6. ^ Richardson CC, Schildkraut CL, Aposhian HV, Kornberg A (januar 1964). „Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. XIV. Further purification and properties of deoxyribonucleic acid polymerase of Escherichia coli”. The Journal of Biological Chemistry. 239: 222—32. PMID 14114848. 
  7. ^ Schachman HK, Adler J, Radding CM, Lehman IR, Kornberg A (novembar 1960). „Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. VII. Synthesis of a polymer of deoxyadenylate and deoxythymidylate”. The Journal of Biological Chemistry. 235: 3242—9. PMID 13747134. 
  8. ^ Zimmerman BK (maj 1966). „Purification and properties of deoxyribonucleic acid polymerase from Micrococcus lysodeikticus”. The Journal of Biological Chemistry. 241 (9): 2035—41. PMID 5946628. 
  9. ^ Lehman IR, Bessman MJ, Simms ES, Kornberg A (jul 1958). „Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. I. Preparation of substrates and partial purification of an enzyme from Escherichia coli”. The Journal of Biological Chemistry. 233 (1): 163—70. PMID 13563462. 
  10. ^ Voet D, Voet JG, Pratt CW (1999). Fundamentals of Biochemistry. New York: Wiley. [potrebna strana]
  11. ^ Brock, T. D. & Freeze, H (1969). Thermus aquaticus, a Nonsporulating Extreme Thermophile”. J. Bacteriol. 98 (1): 289—97. PMC 249935Slobodan pristup. PMID 5781580. 
  12. ^ Bryan, T. Scott (2008). Geysers of Yellowstone, The (4th izd.). University Press of Colorado. ISBN 978-0-87081-924-7. 
  13. ^ Old, R. W., Primrose, S. B. (1994): Principles of gene manipulation. An introduction to genetic engineering. Blackwell Scientific Publications, Oxford.
  14. ^ Bartlett, J. M. S.; Stirling, D. (2003). „A Short History of the Polymerase Chain Reaction”. PCR Protocols. Methods in Molecular Biology. Methods in Molecular Biology. 226 (2nd izd.). str. 3—6. ISBN 978-1-59259-384-2. PMID 12958470. doi:10.1385/1-59259-384-4:3. 
  15. ^ Mullis, Kary B. et al. "Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences" U.S. Patent 4.683.195
  16. ^ „Kary B. Mullis – Nobel Lecture: The Polymerase Chain Reaction”. 

Literatura[uredi | uredi izvor]

Spoljašnje veze[uredi | uredi izvor]