Течна хроматографија високих перформанси

С Википедије, слободне енциклопедије
Течна хроматографија високих перформанси
HPLC. Са лева на десно: Уређај за пумпање формира градијент два различита растварача, челиком појачана колона и апарат за мерене апсорбанце.
АкронимHPLC
КласификацијаХроматографија
Узорциоргански молекули
биомолекули
јони
полимери
Друге технике
СродноХроматографија
Хроматографија водене нормалне фазе
Хроматографија са хидрофилним интеракцијама
Јоноизмењивачка хроматографија
Ексклузиона хроматографија
Мицеларна електрокинетичка хроматографија
Пун називТечна хроматографија-масена спектрометрија
ХПЛЦ апарат.
Модерни HPLC.

Течна хроматографија високих перформанси (HPLC, течна хроматографија под високим притиском) је облик колонске хроматографије који се често користи у аналитичкој хемији. HPLC је техника која се користи за раздвајање, идентификацију и квантификацију компоненти из смесе на основу хемијских интеракција између супстанце која се анализира и стационарне фазе у колони.[1][2][3][4][5]

Најважнија компонента сваког HPLC система је пумпа која пропушта течни растварач који садржи узорак смеше кроз колону испуњену чврстим адсорбентним материјалом. Свака компонента у узорку интерагује на нешто другачији начин са адсорбентним материјалом, узрокујући различите брзине протока за различите компоненте и доводећи до раздвајања компонената док излазе из колоне.

ХПЛЦ се користи у различите сврхе, укључујући производњу (на пример, током процеса производње фармацеутских и биолошких производа), правне сврхе (на пример, детекцију допинг супстанци у урину), истраживање (на пример, сепарацију компонената комплексних биолошких узорака или сличних синтетичких хемикалија), и медицинске сврхе (на пример, детекцију нивоа витамина D у крвном серуму).[тражи се извор] Хроматографија се може описати као процес масеног преноса који укључује адсорпцију. ХПЛЦ се ослања на пумпе које пропуштају притиснуту течност и узорак смеше кроз колону испуњену адсорбентом, што доводи до сепарације компонената узорка. Активна компонента колоне, адсорбент, обично је грануларни материјал састављен од чврстих честица (на пример, силика, полимери, итд.) величине од 2–50 μм. Компоненте узорка се сепаришу због њихових различитих интеракција са честицама адсорбента. Притиснута течност обично представља мешавину растварача (на пример, воду, ацетонитрил и/или метанол) и назива се "покретна фаза". Њена композиција и температура играју значајну улогу у процесу сепарације, утичући на интеракције које се одвијају између компонената узорка и адсорбента. Ове интеракције су физичке природе, као што су хидрофобне (дисперзивне), дипол-диполне и ионске, често у комбинацији. ХПЛЦ се разликује од традиционалне ("нископритисне") течне хроматографије јер су оперативни притисци значајно виши (50–350 бара), док обична течна хроматографија обично зависи од гравитационе силе за пролазак покретне фазе кроз колону. Због мале количине узорка који се сепарише у аналитичкој ХПЛЦ, типичне димензије колоне су пречника 2.1–4.6 мм и дужине од 30–250 мм. Такође, ХПЛЦ колоне се праве са мањим честицама адсорбента (просечне величине од 2–50 μм). Ово даје ХПЛЦ супериорну моћ раздвајања (способност разликовања између једињења) приликом сепарације смеша, што је чини популарном хроматографском техником. Схема ХПЛЦ инструмента обично укључује дегазер, узоркивач, пумпе и детектор. Узоркивач уноси смешу узорка у ток покретне фазе која је носи кроз колону. Пумпе обезбеђују жељени проток и композицију покретне фазе кроз колону. Детектор генерише сигнал који је пропорционалан количини компоненти узорка које излазе из колоне, омогућавајући квантитативну анализу компонената узорка. Дигитални микропроцесор и кориснички софтвер контролишу ХПЛЦ инструмент и пружају анализу података. Неки модели механичких пумпи у ХПЛЦ инструменту могу мешати више растварача у различитим односима током времена, стварајући градиент композиције у покретној фази. Различити детектори се често користе, као што су УВ/Вис, фотодиодни низ (ПДА) или масена спектрометрија. Већина ХПЛЦ инструмената такође има колонску пећницу која омогућава подешавање температуре на којој се сепарација врши.

Начин рада[уреди | уреди извор]

Принцип рада HPLC-а је форсирање проласка анализиране супстанце (или смеше) кроз колону (цев напуњену материјалом ситних честица, а тиме и велике површине) пумпањем течности (мобилна фаза) под високим притиском кроз колону. Уноси се мала запремина узорка у ток мобилне фазе и на основу специфичних хемијских и физичких интеракција, долази до различитог задржавања компонената смеше. Време задржавања зависи од природе супстанце која се анализира, стационарне фазе и састава мобилне фазе. Време за које се супстанца елуира (дође до краја колоне) назива се ретенционо време и оне је карактеристично за одређену супстанцу. Кориштење високог притиска повећава линеарну брзину и даје компонентама мање времена за задржавање, што побољшава резолуцију хроматограма. Користе се уобичајени растварачи, чисти или у било којој комбинацији (нпр. вода, метанол, органски растварачи, итд). Вода може садржавати и неки пуфер, како би се побољшало раздвајање. Могуће је користити и градијентно елуирање, што подразумева промену састава мобилне фазе у току елуирања.

Типови HPLC-а[уреди | уреди извор]

Хроматографија на нормалним фазама[уреди | уреди извор]

Ова метода користи поларну стационарну фазу и неполарну мобилну фазу, а користи се када је супстанца која се анализира поларна. Поларна супстанца се адсорбира и задржава на честицама стационарне фазе. Јачина адсорпције је већа, што је већа поларност супстанце, а самим тиме веће и време задржавања. Кориштење поларнијих растварача у мобилној фази смањује ретенционо време. Овај тип хроматографије је напуштен 1970-тих са развојем HPLC-а на обрнутим фазама, због слабе репродуцибилности, услед промјена на честицама стационарне фазе под утицајем растварача.[6]

Хроматографија на обрнутим фазама[уреди | уреди извор]

HPLC на реверзним фазама (RP-HPLC) користи неполарну стационарну фазу и поларну мобилну фазу. Најчешћа стационарна фаза је силикатна, третирана са RMe2SiCl, где је R алкилна група равног ланца као C18H37 или C8H17. Време задржавања је дуже за мање поларне супстанце. Време задржавања се повећава додатком поларних растварача у мобилну фазу а смањује се додатком хидрофобних растварача. RP-HPLC функционише на принципу хидрофобних интеракција, које су резултат одбијајућих сила између поларног растварача и релативно неполарне супстанце која се анализира и неполарне стационарне фазе.

На брзину елуирања утиче pH, због могућности промене поларности супстанце. Због тога се често у мобилну фазу додају пуфери. Колоне за RP-HPLC не би требало користити са јаким базама, због могућности разградње силикатних честица.

Компоненте уређаја за HPLC[уреди | уреди извор]

Уређај за HPLC се састоји од следећих компонената:

  • Резервоар мобилне фазе
  • Пумпа
  • Ињектор
  • Колона
  • Детектор

Пумпе[уреди | уреди извор]

Најважнија компонента сваког HPLC система је пумпа, чија је улога је да обезбеди прецизан и поуздан ток мобилне фазе кроз колону испуњену чврстим адсорбентним материјалом.

Пумпе за HPLC морају генерисати висок притисак како би обезбедиле адекватан проток растварача кроз колону. Оперативни притисак ових пумпи обично се креће у опсегу од 350 до 500 бара. Овај висок притисак је кључан за ефикасну сепарацију компонената смеше.

Прецизан проток растварача је од суштинског значаја у HPLC анализи. Пумпе морају омогућити тачну контролу протока, који варира у опсегу од 0,1 до 5 mL/min, у зависности од специфичних захтева анализе.

Пумпе често подржавају генерисање градијената протока, што омогућава промену услова сепарације током анализе. Градијент протока се често изражава као промена протока од 0,1 mL/min током одређеног времена. Ова могућност је од значаја за напредне аналитичке процедуре.

Да би се осигурао константан проток, посебно код детектора као што су рефрактометар (RI), детектори кондуктивности (CD) и електрохемијски детектори (ED), пумпе за ХПЛЦ морају радити без стварања пулса у току мобилне фазе. Ово је кључно за добијање тачних и прецизних резултата анализе.

Пумпе за ХПЛЦ треба да буду једноставне за руковање и одржавање. То укључује замену цилиндара, заптивача и вентила како би се очувала њихова перформанса.

Такође, пумпе треба да имају малу запремину како би омогућиле брзу промену састава мобилне фазе. Ово је посебно корисно у анализама које захтевају промене услова сепарације током анализе.

Како би се обезбедила поузданост и трајност пумпи, оне треба да буду отпорне на корозију, стога се данас најчешће праве од титанијума или тефлона.

Одржавање пумпи[уреди | уреди извор]

Одржавање пумпи обухвата замену одређених компоненти као што су заптивачи и цилиндри. Рубинске куглице или цели вентили се чисте или мењају у потпуности. Пумпа не сме да ради без мобилне фазе. Такође је битно никада не остављати раствор пуфера у пумпи како би се спречило формирање кристала у вентилима. Идеална композиција мобилне фазе обично укључује воду са додатком 10% органског растварача како би се спречио раст алги и микроорганизама у систему.

Детектори за HPLC[уреди | уреди извор]

Детектор има важну улогу да одређивања компоненти које излазе из колоне након елуирања. Детектор генерише електрични сигнал који је пропорционалан интензитету неке особине мобилне фазе или супстанце која се елуира. Типови детектора у HPLC-у су:[7]

  • UV-VIS детектор
  • Флуоресцентни детектор
  • Електрохемијски детектор
  • Детектор индекса лома
  • Масени спектрометар (МС)

Види још[уреди | уреди извор]

Референце[уреди | уреди извор]

  1. ^ L. R. Snyder, J.J. Kirkland, and J. L. Glajch, Practical HPLC Method Development, John Wiley & Sons, New York, 1997.
  2. ^ S. Ahuja and H. T. Rasmussen (ed), HPLC Method Development for Pharmaceuticals, Academic Press, 2007.
  3. ^ S. Ahuja and M.W. Dong (ed), Handbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC, Elsevier/Academic Press, 2005.
  4. ^ Y. V. Kazakevich and R. LoBrutto (ed.), HPLC for Pharmaceutical Scientists, Wiley, 2007.
  5. ^ U. D. Neue, HPLC Columns: Theory, Technology, and Practice, Wiley-VCH, New York, 1997.
  6. ^ Линдсаy, С.; Кеалеy, D. (1987). Хигх перформанце лиqуид цхроматограпхy. Wилеy.  from review Хунг, L. Б.; Парцхер, Ј. Ф.; Схорес, Ј. C.; Wард, Е. Х. (1988). „Тхеоретицал анд еxпериментал фоундатион фор сурфаце-цовераге программинг ин гас-солид цхроматограпхy wитх ан адсорбабле царриер гас”. Ј. Ам. Цхем. Соц. 110 (11): 1090. дои:10.1021/ац00162а003. 
  7. ^ Settle, F.A.: Handbook of instrumental techniques for analytical chemistry, Prentice Hall. 1997. ISBN 978-0-13-177338-7.

Спољашње везе[уреди | уреди извор]

Лиqуид Цхроматограпхy на сајту Curlie

Tečna hromatografija visokih performansi на Викимедијиној остави.
Преузето из „https://sr.wikipedia.org/w/index.php?title=Tečna_hromatografija_visokih_performansi&oldid=26788379”