Primarna struktura proteina

Iz Vikipedije, slobodne enciklopedije
Skoči na: navigacija, pretraga
Protein je u stvari lanac aminokiselinskih sekvenci.

Proteini su molekuli aminokiselina povezani peptidnom vezom i to određenim redosledom koji se naziva aminokiselinska sekvenca.[1] Pod primarnom strukturom proteina podrazumeva se, osim njegove aminokiselinske sekvence, i broj polipeptidnih nizova iz kojih se molekul datog proteina sastoji, kao i broj i položaj disulfidnih mostova u njemu.[2]

Posle biosinteze proteini podležu procesima post-translacionih modifikacija u kojim dolazi do kovalentnog vezivanja pojedinih komponenti za bočne ostatke aminokiselina. U primarnoj strukturi proteina sadržano je obilje informacija na osnovu kojih su formirani moderni koncepti u biohemiji. Određivanje primarne strukture proteina jedan je od tipičnih poslova kojima se biohemičari bave.[2]

Peptidna veza[uredi]

α-aminokiseline mogu da grade amidnu vezu između α-amino-grupe jedne i α-karboksilne grupe druge aminokiseline uz eliminaciju molekula vode:

Nastala amidna CO-NH veza naziva se peptidna veza. Pri biosintezi proteina nastanak jedne peptidne veze povezan je sa hidrolizom četiri anhidridne veze u molekulu ATP-a i GTP-a sa ukupnom promenom slobodne energije od oko 60 kJ/mol. Za sintezu peptidne veze je potrebno oko 20 kJ/mol, ostatak se troši u procesu translacije RNK u polipeptid.[2]

Energija aktivacije za reakciju hidrolize je visoka, tako da do hidrolize peptidne veze u vodenom rastvoru dolazi tek u prisustvu katalizatora (kiseline, baze, proteolitički enzimi) koji snižavajući energiju aktivacije, znatno povećavaju brzinu ove reakcije. U odsustvu katalizatora peptidna veza će biti vrlo stabilna i pod fiziološkim uslovima i u eksperimentalnom radu sa proteinima.[2]

Disulfidna veza[uredi]

Disulfidna veza nastaje oksidacijom ostataka cisteina u cistin.

Da bi С-С veza nastala dva dela peptidnog niza treba da se približe i to pod određenim uglom. Disulfidni most -С-С- nastaje između dva polipeptidna niza (kao kod insulina) ili između delova istog polipeptidnog niza (kao kod insulina i ribonukleaze). Dati ostatak cisteina kombinuje se samo sa jednim određenim ostatkom cisteina u polipeptidnom nizu, tako da su kombinacije disulfidnih mostova u jednom proteinu jedinstvene. Nastajanje disulfida nije genetički determinisano. Disulfidni mostovi nastaju posle procesa biosinteze proteina.[2]

Disulfidna veza stabilizuje strukturu proteina i javlja se kod proteina koji se nalaze u ekstracelularnom prostoru. Tipični primeri su zmijski otrov, peptidni hormoni, enzimi digestivnog trakta, imunoglobulini, lizozim, proteini mleka. Proteini koji se nalaze u ćeliji i nikada je ne napuštaju retko sadrže disulfidne mostove. Većina proteina sadrži ili cistein ili cistin, vrlo retko obe aminokiseline.[2]

Nomenklatura[uredi]

Aminokiselina ugrađena u peptidni lanac naziva se (zbog eliminacije vode iz molekula aminokiseline pri građenju peptidne veze) aminokiselinski ostatak, a obeležava se tako što se na kraju naziva aminokiseline sufiks -in zameni sa -il.

Prema IUPAC-IUB konvenciji protein je polipeptidni niz koji sadrži više od 50 aminokiselinskih ostataka, dok se polipeptidni niz koji sadrži 50 i manje aminokiselinskih ostataka naziva peptid. Naziv peptida formira se dodatkom prefiksa za broj aminokiselinskih ostataka u njemu (di-, tri-, tetra-, penta- itd peptid). Oligopeptidi sadrže nekoliko aminokiselinskih ostataka. Polipeptidi koji se sastoje iz identičnih aminokiselinskih ostataka su homopolipeptidi, a oni koji se sastoje iz različitih ostataka heteropolipeptidi.

Redosled aminokiselina u polipeptidnom nizu se piše od kraja na kome se nalazi slobodna α-amino-grupa (N-terminal). Kraj polipeptidnog niza na kome se nalazi COOH grupa naziva se C-terminal. Uobičajeno je da se aminokiselinska sekvenca prikazuje pomoću skraćenica za nazive aminokiselina.[2]

Određivanje primarne strukture proteina[uredi]

Određivanje sekvence aminokiselina sastoji se iz:

  1. razdvajanja polipeptidnih lanaca
  2. kidanja disulfidnih mostova
  3. utvrđivanja aminokiselinskog sastava svakog polipeptidnog lanca
  4. identifikacije N- i C-terminalnih krajeva
  5. fragmentiranja polipeptidnog lanca i određivanja aminokiselinskog sastava svakog fragmenta
  6. ponavljanja koraka 5 korišćenjem druge procedure za sečenje polipeptidnog lanca. Ovim postupkom se dobija preklopljena aminokiselinska sekvenca.
  7. Rekonstrukcije aminokiselinske sekvence celog polipeptida
  8. Određivanje pozicije disulfidnih mostova između dva cisteina

Razdvajanje polipeptidnih lanaca[uredi]

Disocijacija proteina na polipeptidne lance se vrši ekstremnom promenom pH, dodavanjem 8M uree, 6M gaunidijum-hidrohlorida ili visokih koncentracija soli. Pri tome dolazi do narušavanja vodonične veze u proteinu i između proteina i rastvarača. Tako dobijeni polipeptidni lanci se odvajaju prema veličini ili naelektrisanju.

Kidanje disulfidnih mostova[uredi]

Kidanje disulfidnih mostva se vrši:

  • Oksidacijom permravljom kiselinom pri čemu nastaju dva ekvivalentna cisteinske kiseline.
  • Redukcijom disulfidnih mostova 2-merkaptoetanolom. Nakon redukcije se dodaju jodoacetat ili 3-bromopropilamin, da ne bi došlo do rekombinacije С-С veza. Jodoacetat i 3-bromopropilamin modifikuju SH grupe koje više ne mogu da grade disulfidne veze.

Analiza aminokiselinskog sastava[uredi]

Potrebno je hidrolizovati peptidne veze dodatkom jake kiseline ili baze. Pošto su kiseline manje destruktivne za aminokiseline (Ser, Thr, Arg i Cys), više se koriste. Uzorak proteina se rastvara u 6N HCl na 110 ˚C u vremenskom intervalu od 24, 48 i 72 sata. Aminokiselina triptofan se potpuno uništava u kiselinama, a treonin i serin (koje sadrže OH grupu u bočnom lancu) se polako uništavaju. Hidrofobne aminokiseline, valin i izoleucin, se opiru kiselinskoj hidrolizi.

Koncentracija aspargina i glutamina se ne mogu izračunati jer aspargin prelazi u asparginsku kiselinu, a glutamin u glutaminsku kiselinu.

Smeša hidrolizovanih aminokiselina se razdvaja jonoizmenjivačkom hromatografijom ili HPLC-om (engl. high-pressure liquid chromatography). Određuje se koncentracija svake aminokiseline iz smeše. Obe metode su potpuno automatizovane i deo su instrumenta koji se naziva analizator aminokiselina (engl. amino acid analyser). Nakon analize sastava potrebno je utvrditi i redosled aminokiselina u polipeptidu. Zato se određuju N- i C-terminalni krajevi.

Identifikacija N- i C- terminalnih krajeva[uredi]

Analizom N- i C-terminalnih krajeva određujemo koliko je peptidnih lanaca prisutno (jedan N- i C-kraj znači da je prisutan samo jedan peptidni lanac). N-terminalni kraj se identifikuje Edmanovom degradacijom. Ovom metodom se određuje aminokiselinska sekvenca, tako što se odvaja po jedna aminokiselina sa N-kraja i identifikuje. Edmanov reagens (fenilizoticijanat, PITC) u slabo baznom rastvoru, reaguje sa slobodnim aminokiselinskim ostatkom na N-kraju i nastaje feniltiokarbamil derivat (PTC-protein). Dodatkom trifluroacetatne kiseline formira se tiazolinonski derivat koji se odvaja od peptidnog niza (peptidni niz je sada kraći za jednu aminokiselinu). Kada se doda slaba kiselina ovaj derivat postaje PTH (feniltiohidantoin) koji se identifikuje hromatografski. Za identifikaciju HPLC-om, snimi se hromatogram svih standardnih aminokiselina sa kojima se porede aminokiseline dobijene Edmanovom degradacijom. Pri Edmanovoj degradaciji C-terminalni kraj se obično veže za nerastvoran nosač. Instrument koji se koristi je Edmanov sekvenator (engl. Edman sequenator).

C-terminalni kraj se identifikuje korišćenjem enzima karboksipeptidaze, koja seče peptidne veze između dve aminokiseline počevši od C-terminusa. Karboksipeptidaza A (iz goveđeg pankreasa) hidrolizuje sve peptidne veze osim prolina, arginina i lizina. Karboksipeptidaza B (iz svinjskog pankreasa) hidrolizuje samo arginin i lizin, kada su na C-kraju, dok su karboksipeptidaze C i Y efikasne za sve aminokiseline.

Fragmentacija polipeptidnog lanca[uredi]

Fragmentaciju polipeptidnog lanca moguće je izvršiti upotrebom proteolitičkih enzima, koji hidrolizuju specifične peptidne veze. Najčešće korišćeni enzimi su tripsin i himotripsin, koji spadaju u klasu endopeptidaza (proteaza koje hidrolizuju peptidne veze u polipeptidnom lancu).

Tripsin hidrolizuje samo peptidne veze koje su na C-kraju aminokiselina arginin i lizin. Na ovaj način nastaju fragmenti koji na C-kraju imaju Arg ili Lys. Broj fragmenata je jednak broju ove dve aminokiseline plus 1 (C-terminalni peptid proteina).

Himotripsin hidrolizuje peptidne veze formirane između karboksilnih grupa aromatičnih aminokiselina (fenilalanin, tirozin, triptofan). Pošto tripsin i himotripsin hidrolizuju različite peptidne veze, delovi nastalih fragmenata će se preklapati, tako da je moguće rekonstruisati aminokiselinsku sekvencu. Moguće je koristiti i druge enzime: klostripain (hidrolizuje Arg rezidue), endopeptidaza Lys-C (hidrolizuje Lys rezidue), stafilokokna proteaza (hidrolizuje Asp i Glu rezidue). Za nespecifičnu protealizu se koriste: pepsin, papain, termolizin, elastaza itd.

Rekonstrukcija aminokiselinske sekvence[uredi]

Sekvence dobijene fragmentacijom se porede tako što se traže delovi sekvence koji se preklapaju. Na slici je prikazana analiza sekvence proteina katrokolastatina-C. U redu sa oznakom CAT-C je aminokiselinska sekvenca (216 AK), dobijena kombinacijom nekoliko metoda. Red sa oznakom N-Term pokazuje sekvencu dobijenu Edmanovom degradacijom u Edmanovom sekvenatoru. Redovi sa oznakama M1-M5, pokazuju sekvence dobijene proteolitičkim fragmentiranjem cijanogen bromidom, a zatim Edmanovom degradcijom fragmenata M1-M5. Redovi sa oznakama K3-K6, pokazuju sekvence dobijene proteolitičkim fragmentiranjem endopeptidazom Lys-C, a zatim Edmanovom degradacijom fragmenata. Redovi sa oznakama E13-E15, su sekvence dobijene proteolitičkim fragmentiranjem stafilokoknom proteazom, a zatim Edmanovom degradacijom fragmenata.

Određivanje pozicije disulfidnih mostova[uredi]

Da bi odredili položaj disulfidnih veza potrebno je koristiti protein u kome su sve veze očuvane. Metodom dijagonalne elektroforeze se fragmenti (povezani disulfidnim vezama) mogu izolovati.

Koraci pri određivanju pozicije disulfidnih mostova su:

  • Smeša proteinskih fragmenata se nanosi na ivicu papira.
  • Pod uticajem električnog polja, fragmenti migriraju prema katodi.
  • Isečeni deo se drži iznad rastvora permravlje kiseline da bi С-С veze oksidisale.
  • Papir se ponovo stavlja u električno polje, ali se sada elektroforeza radi u pravcu normalnom na prvobitni pravac.
  • Peptidi koji nisu imali disulfidne veze ne migriraju (formiraju dijagonalu), dok fragmenti koji su imali S-S veze migriraju u odnosu na dijagonalu, mogu se izolovati i identifikovati.

[3]

Rekombinantna DNK i sekvenciranje proteina[uredi]

Aminokiselinska sekvenca proteina može da se odredi i na osnovu sekvenciranja odgovarajućeg segmenta u molekulu DNK. Metode za sekvenciranje DNK su brže i jednostavnije od gore opisanih metoda za sekvenciranje proteina. Na ovaj način je određena sekvenca za više od 106 ostataka u više od 3000 proteina. Međutim, i pored toga je direktno određivanje primarne strukture proteina nezamenljivo iz više razloga. Položaj disulfidnih mostova se određuje jedino sekvenciranjem proteina. Mnogi proteini se modifikuju posle biosinteze. Ove modifikacije mogu da se identifikuju samo direktnim sekvenciranjem proteina. U nekim slučajevima nije moguće izdvojiti fragment DNK koji sadrži informacije za sekvencu datog proteina.[2]

Dakle, određivanje aminokiselinske sekvence proteina iz sekvence baza DNK ne može da zameni direktno određivanje primarne structure proteina već je komplementarno sa njim.[2]

Hemijske modifikacije proteina[uredi]

Hemijske modifikacije proteina se primenjuju u ispitivanjima strukture, funkcije i svojstava proteina. Primenjuju se i pri ispitivanju viših nivoa strukture proteina, i za identifikaciju ostataka aminokiselina koji su esencijalni za njihovu aktivnost i funkciju. Protein se inaktivira, a modifikovani ostatak se identifikuje pri određivanju sekvence proteina. Najčešće upotrebljavani reagensi za modifikaciju pojedinih bočnih ostataka aminokiselina u proteinima (grupno specifični reagensi) su: trinitrobenzensulfonska kiselina i etiltiotrifluoroacetat (lizin), 2,3-butandion (arginin), N-metilaleimid, p-hidroksimerkuribenzoat, permravlja kiselina (cistein), ditiotreitol (cistin), cijanogenbromid (metionin), diazometan (sparaginska i glutaminska kiselina), dietilpirokarbonat (histidin), tetranitrometan (tirozin), N-bromsukcinimid (triptofan).

Hemijskim reakcijama podležu samo aminokiseline koje sadrže neku reaktivnu grupu. Bočni nizovi cisteina, lizina, arginina, tirozina, serina, treonina, histidina i metionina mogu da reaguju kao nukleofili; cistein, serin, treonin, triptofan, tirozin i metionin podležu oksidaciji; triptofan, tirozin i fenilalanin elektrofilnoj supstituciji.[2]

Većina reagenasa koji se primenjuju u proteinskoj hemiji reagovaće sa više nego jednim ostatkom aminokiseline u proteinu. Pošto se reaktivnost protonovanog i neprotonovanog oblika bočnih ostataka znatno razlikuju, stepen modifikacije pojedinih bočnih ostataka zavisiće i od njihovih vrednosti pKa i pH reakcione smeše.[2]

Post-translacione modifikacije proteina[uredi]

Slobodna α-amino-grupa polipeptida (N-terminal) može biti kovalentno izmenjena:

  • acetilacijom

\mathrm{-C(=O)-CH_{3}} N-terminal acetilacija: pozitivno naelektrisanje N-terminalne grupe može biti eliinisano promenom u acetil grupu (N-terminal blokada)

  • formilacijom

\mathrm{-C(=O)H} N-terminalni metionin (koji se najčešće sintetiše) blokira N-terminal sa formil grupom. Ova formil grupa se uklanja enzimom deformilazom.

Formilacija
  • formilacijom piroglumatata iz N-terminal glutamina

N-terminal glutamin može sam sebe napasti, formirajući cikličnu piroglutamatnu grupu.

  • miristolacijom

\mathrm{-C(=O)-\left(CH_{2}\right)_{12}-CH_{3}}

Slično kao acetilacija. Umesto jednostavne metil grupe, miristoil grupa ima rep od 13 hidrofobnih ugljenika, koje se čine idealnim za vezivanje proteina za ćelijske membrane.

C-terminalna karboksilatna grupa može takođe biti modifikovana:

miristoilacija
  • amidizacijom

C-terminal može biti blokiran amidizacijom.

  • GPI (glikozil fosfatidilinozitol) pridruživanjem

Glikozil fosfatidilinozitol je veliki, hidrofoban fosfolipid prostetične grupe koji prikuplja proteine u ćelijske membrane. Pridružuje se peptidnoj C termalnoj grupi preko amidnog lančanog spoja, pa se tada povezuje sa etanolaminom, odatle sa raznim šećerima, i konačno se povezuje sa delom fosfatidilinozitol lipida.

Kovalentne izmene bočnog peptidnog lanca[uredi]

FOSFORILACIJA

Fosforilacija je možda najvažnija hemijska modifikacija proteina. PO4 fosfatna grupa vezuje se na proteine. Fosfatna grupa se može pridružiti bočnom lancu hidroksilne grupe serinskog, treoninskog, tirozinskog ostatka, tako što se dodaje negativno naelektrisanje na tom delu i stvara veštačku amino kiselinu. Ovakve reakcuje su katalizovane kinazom dok su reverzibilne reakcije katalizovane fosforilazama. Fosforizovani tirozini se često koriste kao držači sa kojim se proteini pridružuju, međutim fosforilacija Ser-Thr često izaziva konformacione promene, zbog toga što uvodi negativno naelektrisanje.

GLIKOZILACIJA

Glikozilacija obuhvata sve heterogene modifikacije, veoma uobičajene. Delovi šećera mogu biti pridruženi bočnom lancu sa hidroksilnom grupom Ser-Thr ili bočnom lancu amidne grupe Asn. Ovakva pridruživanja mogu da služe mnogim funkcijama, koje se rangiraju po porastu sposobnosti komleksnog prepoznavanja. Ceo proces glikozilacije može biti blokiran određenim inhibitorima kao što je tunikamicin.

HIDROKSILACIJA

Mnogi proteinski ostaci podležu ovom hemijskom procesu koji uvodi jednu ili više hidroksilnih grupa i na taj način ih oksiduje. Reakcija hidroksilacije je katalizovana enzimom koji zahteva askorbinsku kiselinu (vitamin C) čiji deficiti dovode do mnogih bolesti kao npr. skorbut .

DEAMIDIZACIJA

Hemijska reakcija u kojoj amidna funkcionalna grupa biva izbačena iz proteina. U asparaginskom bočnom lancu napada peptidnu grupu i stvara simetrični succinimidni intermedijer.

METILACIJA

Predstavlja zamenu vodonika sa metil gupom. Katalizovana je mnogim enzimima. Nekoliko proteinskih ostataka mogu biti metilizovani a najpoznatije su grupe lizina i arginina sa pozitivnim naelektrisanjem. Metilacija ovih delova se koristi za regulaciju proteinskih funkcija

ACETILACIJA

Ova hemijska modifikacija prevodi acetil funkcionalnu grupu u organske komponente. Acetilacija npr. lizinske amino grupe je hemijski analogna acetilaciji N-terminalnog atoma. Acetilisan lizinski ostatak se koristi za regulaciju vezivanja proteina u nukleinske kiseline.

SULFACIJA

Tirozini se mogu sulfuiratina njegovom Oη atomu. Ova modifikacija se nalazi u Goldžijevom aparatu. Slično fosforizovanim tirozinima, sulfonovani tirozini se koriste za specifična prepoznavanja npr. U čemokine receptorima koji se nalazi u ćelijskoj membrani. Kao i kod fosforilacije, sulfacijom neutralna oblast postaje negativno naelektrisana.

PRENILACIJA I PALMITOILACIJA

\mathrm{-C(=O)-\left(CH_{2}\right)_{14}-CH_{3}}

Prenilacija je proces prevođenja hidrofobnog molekula u proteine. Hidrofobni izopren (npr. farnezil, geranil grupe) i palmitojilske grupe mogu biti pridružene Sγ atomu cisteinskog ostatka.

KARBOKSILACIJA

Relativno retka modifikacija koja dodaje posebnu karboksilatnu grupu npr. glutamatnom bočnom lancu, stvarajući tada Gla ostatak. Koristi se za jačanje veza sa jonima teških metala kao što je kalcijum.

ADP- RIBOZILACIJA

Velika ADP-ribozil grupa može biti ugrađena u nekoliko tipova bočnih lanaca unutar proteina. Ova modifikacija je meta za moćne toksine različitih bakterija npr. Vibrio cholerae, Bordetella pertussis.

UBIKVINACIJA I SUMO-LACIJA

SUMO-lacija proces koji menja lokaciju proteina, dok je ubikvinacija hemijski proces pridruživanja malog proteina ubikvina sa drugim proteinima. Na ovaj način se vrši obeležavanje proteina.

Informacije sadržane u primarnoj strukturi proteina[uredi]

Primarna struktura proteina predstavlja polaznu osnovu u istraživanju složenijih struktura, svojstava i aktivnosti proteina. Proteini se pod fiziološkim uslovima spontano uvijaju u svoju biološki aktivnu konformaciju, iz čega proizilazi da primarna struktura određuje trodimenzionalnu strukturu proteina. Polazeći od primarne strukture moguće je predvideti više nivoe strukture proteina.

Obolela krvna zrnca usled srpaste anemije

Promene u aminokiselinskoj sekvenci proteina mogu da izazovu promene u njegovoj strukturi i funkciji, što za posledicu može imati nastanak bolesti, npr. srpaste anemije. Linus Pauling je otkrio da do srpaste anemije dolazi pri izmeni samo jedne aminokiseline u molekulu hemoglobina i ove bolesti je nazvao molekulskim bolestima.[2]

Modeli formiranja proteina[uredi]

Prvi model za specifično biološko prepoznavanje je princip ključ u bravu. Prema ovom modelu, molekuli, krećući se potpuno slučajno pod dejstvom difuzije (Braunovsko kretanje), međusobno se sudaraju formirajući i razgrađujući slabe nekovalentne veze, sve do trenutka dok dva molekula ne formiraju dovoljan broj ovih veza, koje im omogućavaju da ostanu zajedno, nasuprot termičkom kretanju, koje nastoji da ih razdvoji. Drugim rečima, što je jače vezivanje molekula u kompleks, sporija je njegova disocijacija. U graničnom slučaju, kada je energija formirane veze bliska energiji termičkog kretanja, molekuli disosuju istom brzinom kojom se i vezuju. U drugom graničnom slučaju, energija vezivanja je toliko jaka da do disocijacije gotovo i ne dolazi. Vezivavanje molekula u realnim situacijama odvija se u uslovima između ova dva krajnja ekstrema.[4]

Drugi model koji rešava u velikoj meri problem brzine i tačnosti pojedinih biohemijskih reakcija je model dvostepene međumolske interakcije. Prema ovom modelu svaka biohemijska reakcija može se podeliti u dve faze. U prvoj fazi dolazi do selektivnog prepoznavanja molekula koji učestvuju u reakciji na velikim rastojanjima (nekoliko stotina angstrema), nakon čega pod dejstvom fizičkih sila, na kojima je zasnovano ovo prepoznavanje, molekuli počinju da se kreću jedan prema drugom. U drugoj fazi dolazi do direktnog kontakta između molekula i do odgovarajuće hemijske interakcije (formiranje kovalentne, polarne, vodonične ili neke druge veze).

Mehanizam selektivnog prepoznavanja molekula, učesnika u biohemijskoj reakciji na velikom rastojanju, na kome je bazirana prva faza reakcije, mnogo je teže definisati zbog kompleksnosti samog procesa. Da bi se ovaj proces mogao odigrati potrebno je :

  1. da postoji generisana informacija koja će obezbediti selektivno komuniciranje proteina koji učestvuju u određenoj biohemijskoj reakciji;
  2. da se obezbedi prenos ove informacije između dva molekula koja komuniciraju na rastojanju od nekoliko stotina ili hiljada angstrema i
  3. da se pokrene i održi proces međusobnog približavanja interagujućih molekula na bazi date informacije.

Prvi uslov, zapis informacije, realizovan je rasporedom nukleotida i aminokiselina u primarnoj strukturi informacionih makromolekula. Da bi se realizovala preostala dva uslova nephodno je da dođe do interakcije između molekula koji nosi informaciju i drugih molekula u biološkom sistemu, koji učestvuju u njenom korišćenju. Pomenuta međumolekulska interakcija je komleksan fizički fenomen koji zavisi od velikog broja fizičkih karakteristika interagujućih makromolekula (polarizabilnost, dipolni momenat, elektrofilnost, hidrofilnost itd).[4]

Osnovne karakteristike postojećih metoda za analizu proteina[uredi]

Metode zasnovane na simboličkoj reprezentaciji[uredi]

Ova grupa metoda zasnovana je na prikazivanju primarne stukture sekvence u vidu niza slova. U početku, analiza ovako definisane primarne strukture svodila se na vizuelno pretraživanje redosleda nukleotida ili aminokiselina i određinanje stepena sličnosti među sekvencama. Pretpostavka, koja leži u osnovi ovog prilaza, podrazumeva da veći deo sličnosti u primarnoj strukturi između dve sekvence znači istovremeno i verovatniju sličnost u njihovoj biološkoj funkciji. Od pasebnog značaja je određivanje delova sekvenci koji su zajednički za grupu funkcionalno srodnih sekvenci. Na ovaj način dobijen skup delova naziva se konsenzus sekvenca. Ona predstavlja karakteristične odlike za koje se smatra da su u korelacijisa biološkom funkcijom sekvence. Ovi oblici mogu da posluže i pri prepoznavanju nepoznate biološke funkcije određene sekvence čija je primarna struktura poznata. Smatra se da konzervirani delovi sekvenci sa istom biološkom funkcijom predstavljaju nosioce te funkcije.[4]

Iako je ova metoda u širokoj primeni, vrlo je teško dokazati da je konzervirani deo sekvence relevantan parametar za biološku funkciju.[4]

Metode zasnovane na parametarskoj reprezentaciji[uredi]

Ova grupa metoda je zasnovana na uspostavljanju veze između fizičkih, hemijskih ili nekih drugih parametara nukleotida i aminokiselina i odgovarajuće biološke funkcije sekvence.

Jednu od metoda definisali su Hulmes i njegovi saradnici. Oni su analizirali periodičnost numeričkog niza dobijenog zamenom svake aminokiseline odgovarajućom vrednošću hidrofilnosti.

Druga, veoma aktuelna metoda u oblasti analize sekvenci, je zasnovana na tzv. domenima proteinske sekvence. Domen je karakteristična raspodela aminokiselina date dužine. Konstrukcija strukturnih domena se obično bazira na numeričkom predstavljanju aminokiselina pogodnim parametrom (najčešće različiti parametri hidrofobnosti ili strukturni parametri). Poslednjih godina, u cilju efikasnije identifikacije homolognih domena. Pongor i saradnici su pristupili formiranju specifične baze sekvenciproteinskih domena SBASE. Domeni uključeni u SBASE su segmenti sekvenci sa poznatom strukturom i/ili funkcijom. Neki od tipova korišćeni u ovoj bazi su:

  1. strukturni domeni: delovi sekvenci sa poznatom strukturom;
  2. homologni domeni: predstavljaju regione homologije sa dgugim proteinima i nisu tako strogo definisani kao strukturni domeni; često se koriste za definisanje daljih tipova domena;
  3. ligand-vezujući domeni: segmenti sekvenci za koje poznato da vezuju specifične ligande (npr. DNK, metale, šećere itd.)
  4. ćelijski locirani domeni (npr. domeni transmembranskih proteina: domeni u citoplazmi, transmembranski i ekstracelularni domeni).[4]

Metod informacionih spektara (ISM)[uredi]

Ovaj metod je zasnovan na fizici interakcije među molekulima. Osnovna specifičnost ISMa je u tome što se nukleotidi (aminokiseline) u analizi tretiraju preko realnih vrednosti potencijal elektron-jon interakcije (PEJI) svake pojedine nukleotidne baze (aminokiseline). Na ovaj način uobičajena simbolička reprezentacija primarne strukture nukleotidne ili proteinske se prevodi u numerički niz. Dobijeni numerički niz se dalje u analizi tretira kao konačan, diskretan signal. U slučaju nukleotidnih i proteinskih sekvenci analizira se spektralna funkcija, tzv. informacioni spektar (IS). Osnovna ideja u analizi IS-a bila je da sekvence sa istom biološkom funkcijom moraju imati neke zajedničke informacione karakteristike sadržane u rasporedu aminokiselina. Informacija sadržana u sekvenci je opisana: (1) strukturom spektra i (2) ukupnom snagom signala odgovarajućeg IS-a.[4]

X-kristalografija[uredi]

X-kristalografija je dala prvi direktan uvid u strukturu proteina, i danas je nezamenjiva. Problem je u tome što kristalizovan protein nije isto što i protein u rastvoru i dobijena struktura je prosečna struktura proteina. Princip rada ove metode je da se monohromatski snop X-zraka difraktuje na kristalu proteina, dajući sliku na fotografskom filmu ili na array detektorima. Iz te slike se “ekstrahuju” podaci o strukturi proteina. Ova metoda ne daje podatke o mobilnosti i fleksibilnosti proteina. Te podatke dobijamo NMR-om.[5]

NMR spektroskopija[uredi]

Nuklearno-magnetna-rezonantna spekstroskopija je svestrana spektroskopska disciplina koja može da registruje signale atoma iz različitih položaja u molekulu i pri tome da svaki signal dovede u vezu sa nekom od poznatih spinskih interakcija, glavnim izvorima podataka o molekulskoj strukturi i dinamici.[6]

Biohemijska evolucija[uredi]

Bliske vrste su se razvile iz zajedničkog pretka, iz čega proizilazi da se i svaki protein u datoj vrsti morao razviti iz odgovarajućeg proteina u tom pretku. Proteini koji u različitim organizmima vrše iste funkcije i imaju zajedničko poreklo su homologi proteini. Poređenjem primarnih struktura homologih proteina zapažamo da su one slične, ali ne i identične. Neki aminokiselinski ostaci u sekvenci proteina su ostali u svim organizmima nepromenjeni. Takvi ostaci aminokiselina se nazivaju invarijantni. U drugim slučajevima jedna aminokiselina je zamenjena sličnom (Asp sa Glu ili Lys sa Arg). Ove zamene se nazivaju konzervativne. Postoje i mesta u sekvenci na kojima može da se nađe bilo koja aminokiselina (hipervarijabilna mesta). Na osnovu ovih podataka se izvode zaključci o strukturi i funkciji proteina. Invarijantni ostaci aminokiselina su izuzetno važni za funkciju proteina. Zamena invarijantne aminokiseline izaziva takve promene u trodimenzionalnoj strukturi ili aktivnom mestu proteina da on više ne može da obavlja svoju funkciju.[2]

Uzrok izmena u sekvenci aminokiselina je izmena u sekvenci baza u odgovarajućem segmentu DNK. Svaka zamena baza u nizu DNK dovešće do nastajanja novog para baza u tom položaju, što će se odraziti u novom tripletu (kodonu) u i-RNK (mutacija u jednoj tački). Na osnovu poređenja brzina evolucije proteina u raznim vrstama zaključeno je da greške pri replikaciji DNK nisu glavni uzrok mutacija.[2]

Brzina evolucije proteina je linearna i karakteristična za svaki protein i izražava se jediničnim evolucionim periodom. Jedinični evolucioni period se definiše kao vreme potrebno za promenu 1% aminokiselina u sekvenci posle divergencije vrsta.[2]

Poređenjem sekvenci homologih proteina raznih vrsta uočeno je da je broj izmena aminokiselina u njihovoj sekvenci veći ukoliko su vrste međusobno udaljenije. Relativno evoluciono rastojanje između susednih tačaka grananja izražava se u PAM jedinicama („Percentage of Accepted point Mutations“), što predstavlja broj izmena aminokiselina na 100 aminokiselinskih ostataka u proteinu. Na ovaj način srodstvo među vrstama se može kvantitativno izraziti.[2]

Evolucija proteina udvostručavanjem gena[uredi]

Većina proteina u jednom organizmu pokazuje međusobne sličnosti u aminokiselinskoj sekvenci. Takvi proteini nastaju fuzijom gena. Posle udvostručavanja, gen može prirodnom selekcijom da razvije novu funkciju dok drugi gen obezbeđuje sintezu prvobitnog proteina.[2]

Evolucija proteina može da se podeli na specijaciju i diferencijaciju. Specijacija je evolucija homologih proteina, koji u raznim organizmima imaju istu funkciju. Dok je diferencijacija nastajanje proteina sa različitim funkcijama iz homologih proteina unutar jednog organizma.[2]

Vidi još[uredi]


Reference[uredi]

  1. ^ Donald Voet, Judith G. Voet (2005). „Chapter 7. Covalent structure of proteins and nucleic acids“. Biochemistry (3 ed.). Wiley. ISBN 9780471193500. 
  2. ^ a b v g d đ e ž z i j k l lj m n nj o Vesna Niketić: Princip strukture i aktivnosti proteina, Hemijski fakultet-Univerzitet u Beogradu,1995.
  3. ^ Ana Popović-Bijelić : Praktikum iz biofizičke hemije
  4. ^ a b v g d đ Jadranka M. Lazović : Analiza odnosa strukture i funkcije proteina zasnovana na parametarskoj reprezentaciji primarne strukture proteina, doktorska disertacija,1995.
  5. ^ Goran Bačić, predavanje
  6. ^ Slobodan Macura, Nenad Juranić: Određivanje strukture proteina nuklearno-tangentno-rezonantnom spektroskopijom

Literatura[uredi]

Literatura[uredi]