Molekularna biologija

Molekularna biologija je nauka koja proučava biologiju na molekularnom nivou. Međutim ova nauka nije usko definisana, već se preklapa sa prirodnim naukama kao što su biologija i hemija, a naročito se preklapa sa genetikom i biohemijom. Za predmet proučavanja molekularna biologija se najviše interesuje za interakcije i regulacije između sistema unutar same ćelije, uključujući odnose između DNK, RNK, proteina i njihove biosinteze, kao i regulacije tih interakcija. Pišući u časopisu Nature 1961. godine, Vilijam Astburi je opisao molekularnu biologiju kao:

...ne toliko tehnika koliko prilaz, pristup sa stanovišta takozvanih osnovnih nauka sa vodećom idejom potrage ispod velikih manifestacija klasične biologije za odgovarajućim molekularnim planom. Posebno se bavi formama bioloških molekula i [...] pretežno je trodimenziona i strukturalna – što ne znači, međutim, da je to samo usavršavanje morfologije. U isto vreme mora istraživati o genezu i funkciju.

Odnos prema drugim biološkim naukama

Šematski odnos između biohemije, genetike i molekularne biologije

Molekularni biolozi koriste posebne tehnike, odnosno metode, ali takođe kombinuju molekularne tehnike sa tehnikama koje pripadaju genetici, biohemiji i biofizici. Danas više ne postoji jasno definisana granica između biohemije, molekularne biologije i genetike, jer se jedna nauka u velikoj meri oslanja na istraživanja i pronalaske druge. Ove tri nauke se mogu definisati na sledeći način:

• Biohemija je studija hemijskih supstanci i vitalnih procesa koji se odvijaju u živim organizmima. Biohemičari stavljaju primarni fokus na ulozi, funkciji i strukturi biomolekula. Izučavanje hemije u osnovi bioloških procesa i sinteza biološki aktivnih molekula su primeri biohemijskih aktivnosti.
• Genetika je studija uticaja genetičkih razlika na organizme. Ove razlike se često mogu uočiti putem odsustva normalne komponente (npr, jednog gena), u studijama „mutanata” — organizama sa promenjenim genom što dovodi do toga da se organizam razlikuje u odnosu na takozvani „divlji tip” ili normalni fenotip. Genetičke interakcije (epistaze) često mogu da otežaju jednostavna tumačenja takvih „nokaut” studija (uklanjanja ili dodavanja gena).
• Molekularna biologija je studija molekularne osnove procesa replikacije, transkripcije i translacije genetičkog materijala. Centralna dogma molekularne biologije prema kojoj se genetičkim materijal transkribuje u RNK i zatim translira u protein, uprkos toga što je prekomerno pojednostavljen prikaz molekularne biologije, još uvek pruža dobru početnu tačku za razumevanje polja. Ovo gledište, međutim, podleže revizijama u svetlu otkrića novih uloga RNK.
• Hemijska biologija nastoji da razvije nove alate na bazi malih molekula koji omogućavaju minimalne perturbacije bioloških sistema uz pružanje detaljnih informacija o njihovoj funkciji. Osim toga, hemijska biologija primenjuje biološke sisteme da kreira veštačke hibride između biomolekula i sintetičkih konstrukcija (na primer pražnjenje virusnih kapsida kojim se može isporučiti genska terapija ili molekul leka).

Velikim delom, molekularna biologija je kvantitativna nauka, i poslednjih godina molekularna biologija se preklapala sa informatikom u bioinformatici i statističkoj biologiji. Početkom 2000. godine, proučavanjem strukture i funkcije gena, intenzivno je počela da se bavi podgrupa molekularne biologije molekularna genetika, i bila je među najprominentnijim potpoljima molekularne biologije. U sve većoj meri mnoge druge oblasti biologije stavljaju fokus na molekule, bilo direktno studirajući same interakcije kao što su citologija i biologija razvića, ili indirektno, pri čemu se biološke tehnike koriste za sticanje uvida u istorijske osobenosti populacija ili vrsta, kao što se to čini u poljima evolucione biologije poput populacione genetike i filogenetika. Isto tako postoji duga tradicija izučavanja biomolekula „iz temelja” u biofizici.

Tehnike molekularne biologije

Krajem 1950-ih i početkom 1960-ih molekularni biolozi su naučili kako da karakterišu, izoluju i manipulišu molekularnim komponentama ćelija i organizma. U ove komponente spadaju DNK, RNK, bliski srodnik DNK-a čija se uloga proteže od privremene kopije DNK-a do translacije i sinteze proteina, i proteini, strukturno važne komponente ćelija.

Molekulsko kloniranje

Glavni članak: Molekulsko kloniranje

Transdukcijska slika

Jedna od najosnovnijih tehnika molekularne biologije u studiranju proteinske funkcije je molekulsko kloniranje. U ovj tehnici, DNK kodiranje za dati protein klonira koristeći reakciju lančane polimerizacije (PCR), i/ili restrikcione enzime u plazmidu (vektoru izražavanja). Vektor ima tri osobena svojstva: početno mesto replikacije, višestruka mesta kloniranja (MCS), i selektivni marker obično antibiotičke otpornosti. Locirani ispred mesta višestrukog kloniranja su promoterski regioni i mesta transkripcionog početka koja regulišu izražavanje kloniranog gena. Ovaj plazmid se može biti umetnut u bilo bakterijske ili životinjske ćelije. Uvođenje DNK u bakterijske ćelije se može izvesti putem transformacije kojom se unosi ogoljena DNK, konjugacije posredstvom međućelijskog kontakta ili putem transdukcije koristeći virusni vektor. Uvođenje DNK u eukariotske ćelije, kao što su životinjske ćelije, koristeći fizička ili hemijska sredstva se naziva transfekcija. Nekoliko različitih transfekcionih tehnika je dostupno, kao što je kalcijum fosfatna transfekcija, elektroporacija, mikroinjekcija i lipozomna transfekcija. Plazmid može da bude integrisan u genom, što dovodi do stabilne transfekcije, ili može da ostane nezavistan od genoma, što se naziva prolaznom transfekcijom.

Polimerizovana lančana reakcija

Glavni članak: Lančana reakcija polimeraze — PCR

Polimerizovana lančana reakcija je veoma svestrana tehnika za umnožavanje DNK molekula. Ukratko, polimerizovana lančana reakcija omogućava da se jedna odabrana sekvenca DNK molekula kopira milijardu puta za manje od dva sata. Ova tehnika takođe omogućava i manipulisanje DNK uzorkom. Na primer, PCR može da se koristi kako bi se ubacila mesta na kojima deluju restriktivni enzimi, ili da mutira unapred određene baze DNK, što je metod koji se naziva mutagenezom usmerenom na mesto. PCR isto se tako može koristiti za određivanje prisustva datog DNK fragmenta u kDNK kolekciji. PCR ima mnoge varijacije, kao što je reverzno transkripciona PCR (RT-PCR) za pojačavanje RNK, i odnedavno, kvantitativna PCR koja omogućava kvantitativna merenja DNK ili RNK molekula.

Polimorfizam dužine amplificiranih fragmenata

Glavni članak: Polimorfizam dužine amplificiranih fragmenata − AFLP

Polimorfizam dužine amplificiranih fragmenata je takođe jedan od važnih alata u molekularnoj biologiji. Prednost ovog metoda je mogućnost detekcije velikog broja polimorfizama na određenim dužinama fragmenata DNK molekula. AFLP je postao jedan od bitnijih alata u genotipizaciji koja za cilj ima proučavanje genetskog biodiverziteta.

Analiziranje DNK rezultata

Glavni članak: DNK analiza

Nakon dobijenih rezultata, potrebno je tumačiti dobijene informacije, i time se bavi ova nauka.

Gelska elektroforeza

Razdvajanje DNK fragmenta kroz poliakrilamid gel na osnovu veličina fragmenata. DNK molekuli koji se kreću ka anodi, na donjem delu gela, su tamno ljubičaste boje

Glavni članak: Elektroforeza

Gelska elektroforeza je jedna od osnovnih tehnika molekularne biologije. Osnovna ideja je ta da DNK, RNK i proteini mogu da se razdvoje koristeći karakteristike električnog polja pod čijim uticajem se ovi molekuli kreću na gelu. U elektroforezi se najčešće koristi želatin napravljen od agaroze, i u tom želatinu DNK i RNK mogu da se razdvoje na osnovu veličine. Za proteine se koristi poseban tip želatina. Proteini se takođe mogu razdvojiti na osnovu njihove naelektrisanosti, pritom koristeći izoelektričan želatin.

Makromolekulsko blotiranje i ispitivanje

Termini severno, zapadno i istočno blotiranje su izvedeni iz onog što je inicijalno bila molekularno biološka šala na račun termina sadern blotiranje, po tehnici koju je opisao Edvin Sadern za hibridizaciju obeležene DNK. Patrisija Tomas, koja je razvila RNK blot koji je zatim postao poznat kao norden blot, zapravo nije koristila taj termin.

Metodi

Laboratorija za molekularnu ćelijsku biologiju

Postoji više metoda molekularne biologije:

Izolacija nukleinskih kiselina

DNK se može izolovati iz svake ćelije sa jedrom, a u medicinskoj praksi najčešće se dobija iz limfocita periferne krvi ili brisa sluzokože usta. Izvor DNK može da bude, po potrebi, i uzorak horionskih resica ili amnionske tečnosti, koren dlake, trag telesnih tečnosti (kap krvi, semena tečnost, pljuvačka) urin, likvor, i sl. Klasičan postupak izolacije DNK obuhvata razlaganje ćelijskih i jedarnih membrana, oslobađanje DNK od proteina i njeno precipitovanje u alkoholu (absolitni etanol ili izopropanol). Izolovana DNK predstavlja nasledni materijala iz svih ćelija sa jedrom koje su se nalazile u datom uzorku, i naziva se ukupna genomska DNK. Ova DNK je stabilna, može da se čuva u vidu vodenog rastvora (na +4 ili -200C) dugo vremena i da se koristi za različite analize. Za dalje analize potrebno je znati tačnu koncentraciju i čistoću dobijenih nukleinskih kiselina, što se utvrđuje merenjem na spektrofotometar. Kvalitet izolovanog materijala može se proceniti i gel-elektroforezom.

Gel-elektroforeza

Ovom tehnikom postiže se razdvajanje molekula DNK ili RNK u električnom polju, kada se oni kreću kroz specijalno pripremljeni želatinozni medijum, označen kao gel. U polju jednosmerne struje DNK i RNK se kreću prema pozitivnom polu (anodi), budući da su fosfatne grupe u okosnici molekula nosioci negativnog naelektrisanja. Molekuli se razdvajaju pre svega srazmerno svojoj veličini, tako da se kraći kreću brže a duži sporije. Klasični gelovi za elektroforezu nukleinskih kiselina su ploče izrađene od agaroze ili poliakrilamida. Uočavanje — vizuelizacija fragmenata se vrši bojenjem gelova bojama koje imaju afinitet za nukleinske kiseline (etidijum-bromid, srebro-nitrat).

Restrikcione endonukleaze

Restrikcione endonukleaze su enzimi koji omogućavaju precizno i tačno definisano isecanje molekula DNK, i stoga se koriste kao svojevrsne „molekularne makaze”. U laboratorijskom radu, ovi enzimi se koriste za ciljano isecanje molekula DNK na fragmente, koji su nazvani restrikcioni fragmenti. Restrikcione endonukleaze funkcionišu tako što u molekulu DNK prepoznaju specifične nizove od prosečno 4-8 nukleotida i seku DNK na tačno određnom mestu u okviru tih nizova. Mesta preseka se zovu restrikciona mesta. Regioni koje prepoznaju restrikcioni enzimi imaju palindromsku strukturu, što znači da jedan lanac čitan sleva nadesno i drugi lanac čitan zdesna nalevo, imaju isti niz nukleotida. Krajevi isečenog fragmenata mogu da budu kosi — jednolančani, ili zaravnjeni, što zavisi od strukture palindromskog niza i položaja restrikcionog mesta. Restrikcione endonukleaze se označavaju skraćenicama, prema mikroorganizmu iz koga potiču (npr. EcoRI iz E. coli, BglI iz Bacterium bulgaricum). Постоји неколико стотина ових ензима, а сваки препознаје специфичан низ нуклеотида и у оквиру њега има своје одређно рестрикционо место. Рестрикционе ендонуклеазе се користе у припреми материјала за технологију рекомбиноване ДНК и Садерн блот, затим за анализу полиморфизама ДНК и детекцију тачкастих мутација, итд.

Историја

Молекуларна биологија је основана као наука 1930, али само име науке је настало тек 1938. од стране Ворен Вивера. Вивер је био директор Природних Наука као подгрупа Рокфелер фондације. Вивер је веровао да је биологија у то време била на путу значајних промена и напредака, као што су рендгенска кристалографија. Због овог његовог веровања пуно новца из Рокфелер фондације је утрошено на биологију и сродне јој науке.

Познати молекуларни биолози

• Розалинда Френклин
• Франсис Крик
• Џејмс Д. Вотсон

Литература

• Lessard, Juliane C. (1. 1. 2013). Molecular cloning. Methods in Enzymology. 529. стр. 85—98. ISBN 978-0-12-418687-3. ISSN 1557-7988. PMID 24011038. doi:10.1016/B978-0-12-418687-3.00007-0. 
• Alberts, Bruce; Johnson, Alexander; Lewis, Julian; Raff, Martin; Roberts, Keith; Walter, Peter. Isolating, Cloning, and Sequencing DNA (на језику: енглески). Приступљено 31. 12. 2016. 
• Alberts, Bruce; Johnson, Alexander; Lewis, Julian; Morgan, David; Raff, Martin; Roberts, Keith; Walter, Peter (2014). Molecular Biology of the Cell, Sixth Edition. Garland Science. стр. 1—10. ISBN 978-1-317-56375-4. 
• Berg, Jeremy M.; Tymoczko, John L.; Stryer, Lubert; Berg, Jeremy M.; Tymoczko, John L.; Stryer, Lubert (2002). Biochemistry (5th изд.). W H Freeman. ISBN 978-0-7167-3051-4. 
• Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Zipursky, S. Lawrence; Matsudaira, Paul; Baltimore, David; Darnell, James (2000). Molecular cell biology (4th изд.). New York: Scientific American Books. ISBN 978-0-7167-3136-8. 
• Solomons, W. T.; Fernandez, Jack E. (1995). Study Guide to Accompany Organic Chemistry (5th изд.). ISBN 978-0-471-54741-9. 
• Cohen, S.N., Chang, A.C.Y., Boyer, H. & Heling, R.B. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 70, 3240—3244 (1973).
• Rodgers, M. The Pandora's box congress. Rolling Stone 189, 37—77 (1975).
• Roberts, Keith; Raff, Martin; Alberts, Bruce; Walter, Peter; Lewis, Julian; Johnson, Alexander. Molecular Biology of the Cell. 
  • 4th Edition, Routledge, March, hardcover, 1616 pages, 7.6 pounds. 2002. ISBN 978-0-8153-3218-3.
  • 3rd Edition, Garland. 1994. ISBN 978-0-8153-1620-6.
  • 2nd Edition, Garland. 1989. ISBN 978-0-8240-3695-9.

Spoljašnje veze

• Biochemistry and Molecular Biology na sajtu Curlie
• Institut za molekulsku i ćelijsku biologiju
• Nature Reviews
• Stanfordska enciklopedija
• Virtualna biblioteka biohemije i molekularne biologije
• Molekulska i ćelijska biologija
• Institut za molekularnu genetiku i genetičko inženjerstvo